Circular RNAs (circRNAs) ble først oppdaget som ikke-kodingerende RNAs i 1979; det var ikke før 2015 at transkriberte circRNAs ble funnet i Drosophila, noe som førte til studiet av circRNAs in vitro for terapeutiske og forebyggende formål.
circRNAs er selv-utvidende og har derfor ikke en konvensjonell struktur som en 5' kappe eller 3' polyA-hale. Denne strukturen gjør dem mer stabile og motstandsdyktige mot exonukleaser som RNase R.
Strukturelle elementer i Circular RNA (circRNA)
Mal-DNA for circRNA-syntese omfatter typisk et intern ribosom-inngangssone (IRES), åpen lesningsramme (ORF) og andre som er kritiske for in vitro-sirkulasjon. For eksempel, designet vi et plasmid som mal for in vitro-transkript (IVT), som består av homologiarmer, 3’ intron, 3’ exon, IRES, ORF, 5’ exon og 5’ intron, for å forberede circRNA ved selvsplicing-metoder.
Intern Ribosome Entry Site (IRES) utfører viktige roller i oversettelsen av cirRNAs. Encephalomyocarditis-virus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, menneskelig rhinovirus B3 (HRV-B3) IRES og andre IRES har blitt vanligvis brukt for oversettelsen av vitro-syntesen av cirRNAs.
In vivo syklisering av circRNA-lineære forløp gir en viktig trinn i circRNA-syntesen, vanligvis gjennom kjemiske, enzymatiske og ribosom-mediert selv-replikasjonsveier. Kjent som en milepæl på feltet, den kjemiske metoden for circRNA-produksjon, opprinnelig fra 1988, brukes ikke lenger idag grunnet dens høye kostnad, lav utbytte, mange sidosprodukter, og at den bare er egnet for syklisering av RNAs opp til 70 nukleotider i lengde.
Enzygotiske metoder for å cyclisere RNA bygger på bakteriofag T4-enzym eller ribozym som T4 DNA ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA ligase 1 (T4 Rnl 1) og T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl 2). For å danne sirkulært RNA ved hjelp av T4-bakteriofagenzym, må nukleosidmonofosfatene være plassert på 5'-enden og koblet til OH-gruppen på 3'-enden av RNA. Fordi nukleosidtrifosfat legges til under reaksjonen, inneholder IVT-RNA guanosintrifosfat (GTP) på 5’-enden.
Ribozym er RNA-sekvenser som fremmer selv-splicing ved å konvertere lineære RNA-molekyler til circRNA uten behov for ytterliggare enzummer. Den selv-sammenstilling prosessen involverer to etterfølgende transesterifikasjonsreaksjoner på spesifikke steder for å sikre at de ønskede cirRNA-produktene dannes. Gruppe I intron selv-splicing-metoden, også kjent som PIE (intron og eksong kapseles inn), som tillater produksjon av cirRNAs lenger enn 5 kb, har blitt omfattende studert og vist seg nyttig.
Anvendelse av Circular RNA (circRNA)
CircRNA-vaksiner
Liksom lineære mRNAs kan circRNAs bli omgjort til bestemte proteiner i målceller og utløse en sterkt humoral ogzellbasert immunforsvar. Nylig har noen forskningsteam vist framgang med å utvikle circRNA-vaksiner for å forebygge COVID-19. Deres resultater har ikke bare haft fordelen ved lineære mRNA-vaksiner, men også vist en bedre stabilitet og en lengre varighet for proteinettrykk enn lineære mRNA. Derfor kan circRNA-vaksiner utløse tilstrekkelige immunsvar selv ved lave doser.
I tillegg mener noen forskere at circRNA-vaksiner, som neste generasjons mRNA, kan bli effektive verktøy i fremtiden for å bekjempe vanlige virus-/bakteriellesykdommer og store nyopptåtte smittsomme sykdommer, samt for behandling av kreft og andre sykdommer.
CircRNA i CAR/TCR-T-terapi
Som en pioner innenfor feltet av sirkulær RNA har ORNA utviklet in situ kimerisk antigenreseptor (CAR) terapi for in situ behandling som bruker ORN-101, et LNP-kapslet sirkulært RNA, for å modulere immunsellene hos pasienter. ORN-101 viser høy uttrykkelse av CAR drivet av en optimalisert IRES-element. I dyreforsøk viste ORN-101 seg å kunne forårsake tumsundertrykkelse og ødelegging, noe som antyder at ORN-101-baserte kreftbehandlinger kan interferere med konvensjonelle CAR-T-celleterapi.
I tillegg evaluerte Zhang et al. overlevelsen og terapeutiske effekten av circRNA i antigen-spesifikke T-celle-reseptor (TCR)-T-behandlinger. De designet en circRNA som koderte pp65-TCR-T rettet mot pp65-epitopet fra cytomegalovirus (CMV). I tillegg demonstrerte pp65-TCR seg å bli uttrykt på primære T-celler i over 7 dager. I tillegg drepte circRNA-pp65-TCR-T-celler spesifikt og konsekvent tumorer som uttrykte pp65 og HLA, og betydelig utstrakte de musenes overlevelsestid.
Det ble også vist at celler som var transfeksjonert med pp65 circRNA utviste bedre immunresponser enn lineær mRNA.
Yaohai’s Bio-Pharma Enkeltløsning CRDMO for Langt Kodende RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
