RNAs bulat (circRNAs) pertama kali ditemui sebagai RNAs tidak bertindak pada tahun 1979; tidak sampai pada tahun 2015 bahawa circRNAs yang ditranskrip ditemui dalam Drosophila, yang membawa kepada kajian circRNAs in vitro untuk tujuan terapi dan pencegahan.
circRNAs adalah berkembang sendiri dan oleh itu tidak mempunyai struktur konvensional seperti topi 5' atau ekor polyA 3'. Struktur ini membuatkan mereka lebih stabil dan tahan terhadap exonukleasa seperti RNase R.
Elemen Struktur RNA Bulat (circRNA)
DNA templat untuk sintesis circRNA biasanya merangkumi laman masuk ribosom dalaman (IRES), kerangka baca terbuka (ORF), dan lain-lain yang penting untuk sirkulasi in vitro. Sebagai contoh, kami telah mendesain suatu plasmid sebagai templat transkrip in vitro (IVT), yang terdiri daripada lengan homologi, intron 3', ekson 3', IRES, ORF, ekson 5', dan intron 5', untuk menyediakan circRNA dengan kaedah self-splicing.
Tapak Masuk Ribosom Dalaman (IRES) memainkan peranan penting dalam translasi cirRNAs. IRES Encephalomyocarditis virus (EMCV), IRES coxsackievirus B3 (CVB3), IRES rhinovirus B3 manusia (HRV-B3) dan IRES lain telah digunakan secara amnya untuk translasi sintesis vitro cirRNAs.
Siklisaan in vivo prasekatan linear circRNA menyediakan langkah penting dalam sintesis circRNA, biasanya melalui laluan kimia, enzimatik, dan pereplikan diri yang dimediasi ribosom. Dikenali sebagai batu asas dalam bidang ini, pendekatan kimia untuk pengeluaran circRNA, yang bermula pada tahun 1988, tidak lagi digunakan hari ini kerana kos tinggi, hasil rendah, bilangan produk sampingan yang tinggi, dan ia hanya sesuai untuk mengikat kitaran RNA sehingga 70 nukleotida panjang.
Kaedah enzimatik untuk mengitar RNA adalah berdasarkan kepada enzim bacteriophage T4 atau ribozim seperti T4 DNA ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA ligase 1 (T4 Rnl 1), dan T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl 2). Untuk membentuk RNA bulat dengan enzim bacteriophage T4, nukleosida monofosfat mesti terletak di hujung 5' dan digabungkan dengan kumpulan OH pada hujung 3' RNA. Oleh kerana nukleosida trifosfat ditambah semasa tindak balas, RNA IVT mengandungi guanosin trifosfat (GTP) pada hujung 5'.
Ribozim adalah urutan RNA yang memupuk self-splicing dengan menukar molekul RNA linear kepada circRNA tanpa keperluan enzim tambahan. Proses self-assembly melibatkan dua tindak balas transesterifikasi berturutan pada lokasi tertentu untuk memastikan produk cirRNA yang diingini terbentuk. Kaedah self-splicing intron kumpulan I, juga dikenali sebagai PIE (pemencapaian intron dan ekson), yang membolehkan pengeluaran cirRNAs lebih panjang daripada 5 kb, telah dikaji secara meluas dan terbukti berguna.
Penggunaan RNA Bulat (circRNA)
Vaksin circRNA
Seperti mRNA linear, circRNA boleh ditukar kepada beberapa protein dalam sel sasaran dan memancing imuniti humoral dan selular yang kuat. Baru-baru ini, terdapat beberapa pasukan penyelidik yang berjaya mengembangkan vaksin circRNA untuk mencegah COVID-19. Keputusan mereka tidak hanya mempunyai faedah vaksin mRNA linear, tetapi juga menunjukkan kestabilan yang lebih baik dan tempoh pengungkapan protein yang lebih panjang berbanding mRNA linear. Oleh itu, vaksin circRNA boleh memancing tanggapan imun yang mencukupi walaupun pada dos rendah.
Selain itu, beberapa penyelidik berpendapat bahawa vaksin circRNA, sebagai mRNA generasi seterusnya, mungkin menjadi alat yang cekap di masa depan untuk menentang penyakit virus/bakteria biasa dan penyakit menular baru utama, serta untuk rawatan kanser dan penyakit lain.
circRNA dalam Terapi CAR / TCR-T
Sebagai pelopor dalam bidang RNA bulat, ORNA telah membangunkan terapi reseptor antigen kimerik (CAR) in situ untuk terapi in situ yang menggunakan ORN-101, sebuah RNA bulat yang ditempah dalam LNP, untuk mengawal sel-sel imun dalam pasien. ORN-101 menunjukkan pengungkapan CAR pada tahap tinggi yang dikuasai oleh elemen IRES yang telah dioptimumkan. Dalam model haiwan, ORN-101 telah ditunjukkan boleh menyebabkan penindasan dan pemusnahan tumor, mencadangkan bahawa terapi antivirus berdasarkan ORN-101 mungkin mengganggu terapi sel CAR-T konvensional.
Selain itu, Zhang et al. menilai kelangsungan hidup dan keberkesanan terapeutik circRNAs dalam terapi penerima sel T spesifik antigen (TCR)-T. Mereka merancang sebuah circRNA yang mengandungi pp65-TCR-T yang menargetkan epitop pp65 virus sitomegalovirus (CMV). Selain itu, pp65-TCR telah dibuktikan diungkapkan pada sel T asal lebih daripada 7 hari. Tambahan lagi, sel circRNA-pp65-TCR-T secara spesifik dan konsisten membunuh sel tumor yang mengungkapkan pp65 dan HLA serta secara signifikan memperpanjang masa hidup tikus.
Ia juga ditunjukkan bahawa sel yang ditransfek dengan pp65 circRNA menunjukkan tanggapan imun yang lebih baik berbanding mRNA linear.
Yaohai’s Bio-Pharma One-Stop CRDMO Solution for Long-Coding RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
