Ympyrämuotoiset RNAt (circRNAs) löydettiin ensimmäisen kerran ei-koodivina RNA:na vuonna 1979; vasta vuonna 2015 transkriboitujen circRNA:molekyylejä havaittiin Drosophilassa, mikä johti in vitro circRNA:n tutkimiseen terapeuttisiin ja ehkäisymiin liittyvissä tarkoituksissa.
circRNA:t laajenevat itsestään eivätkä niillä ole perinteistä rakenetta, kuten 5' kappea tai 3' polyA häntä. Tämä rakenne tekee niistä vakaampia ja kestämättömiä exonukleaseille, kuten RNase R:lle.
Ympyrämuotoisen RNA:n (circRNA) rakenteelliset elementit
CircRNA:n synteesiin käytettävä malli-DNA sisältää yleensä sisäisen ribosomiin pääsypunaisen (IRES), avoimen lukukoodin (ORF) sekä muita tekijöitä, jotka ovat keskeisiä in vitro sykloinnin kannalta. Esimerkiksi suunnittelimme plasmidin käyttämään in vitro-transkriptio- (IVT) mallina, joka koostuu homologialta-aremoista, 3’ intronista, 3’ eksonesta, IRES:stä, ORF:sta, 5’ eksonesta ja 5’ intronista valmistamaan circRNA:a itse-splice-metodeilla.
Sisäinen ribosomiin pääsyalue (IRES) suorittaa tärkeitä tehtäviä cirRNA-molekyylien kääntämisen yhteydessä. Encephalomyokarditikus-virus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, ihmishiero-B3 (HRV-B3) IRES ja muut IRES:t ovat yleisesti käytettyjä vitro-synteesissä tapahtuvan cirRNA-käännöksen mahdollistamiseksi.
CircRNA:n lineaaristen esikuva-aineiden in vivo sykliroiminen on tärkeä vaihe circRNA-synteesissä, usein kemiallisten, enzyymisten ja ribosomiin perustuvien itse-replikoituvien polkujen kautta. Tunnetaan merkkipaineksi tällä alalla, kemiallinen lähestymistapa circRNA:n tuotantoon, joka kehittyi vuonna 1988, ei enää ole käytössä tämän päivän menetelmien takia sen korkean hinnan, matalan tuoton, suuren sivutoimituotteiden määrän sekä sen takia, että se sopii vain RNA-syklirointiin, jonka pituus on enintään 70 nukleotiidia.
Enzyymiset menetelmät RNA:n sykloimiseksi perustuvat bakteerifagi T4-ensiymeihin tai ribosyymeihin, kuten T4 DNA-liigase (T4 Dnl 1), T4 RNA-liigase 1 (T4 Rnl 1) ja T4 RNA-liigase 2 (T4 Rnl 2). Kun T4-bakteerifagien ensiymit käytetään muodostamaan ympyrämuotoista RNA:a, nukleosidi-monofosfaattien on oltava paikoillaan RNA:n 5' päässä ja liitettynä OH-ryhmään RNA:n 3' päässä. Koska nukleosidi-trifosfaatteja lisätään reaktiossa, IVT-RNA sisältää guanosini-trifosfaatin (GTP) 5' päässä.
Ribosyymit ovat RNA-sekvenssejä, jotka edistävät itse-splicingia muuttamalla suoraa RNA-molekyyliä circRNA:ksi ilman tarvetta lisätä muita enzyymejä. Itse-kokoontumisprosessi sisältää kaksi peräkkäistä transesterifiointireaktiota tiettyjen sijaintien varmistamiseksi, että halutut cirRNA-tuotteet muodostuvat. Ryhmän I intron itse-splicing-menetelmää, jota tunnetaan myös nimellä PIE (intron ja ekson inkapselointi), on tutkittu laajasti ja se on osoittautunut hyödylliseksi tuottamaan cirRNA:ita, jotka ovat pidempiä kuin 5 kb.
Ympyränmuotoisen RNA (circRNA) soveltaminen
CircRNA-rokotteen
Kuten lineaariset mRNAt, circRNAt voivat muuttua tietyiksi proteiineiksi kohdepyöreissä ja herättää vahvaa humoraalista ja solullista keuhkovedettä. Viime aikoina joitakin tutkimusryhmiä on onnistunut kehittämään circRNA-rokotteita estääkseen COVID-19:tä. Heidän tuloksensa ovat ehdottomasti saaneet hyödyt lineaaristen mRNA-rokotteiden lisäksi osoittautuneet paremmin vakautetuiksi ja tuoneet pitkäkestoisen proteiinien ilmaisun kuin lineaarinen mRNA. Siksi circRNA-rokotteet voivat herättää riittäviä keuhkovede-vasteita jopa alhaisilla annosasteilla.
Lisäksi jotkut tutkijat uskovat, että circRNA-rokotteet, seuraavana sukupolvena mRNA:ja, saattavat tulla tehokkaiksi työkaluiksi tulevaisuudessa taisteluun yleisten virustautien ja bakteeritautien sekä merkittävien uusien tartuntatautiensa vastaisessa taistelussa, samoin kuin syöpän ja muiden tautien hoidossa.
CircRNA CAR/TCR-T -terapissa
Näyttelijänä pyörimisen rinnakkaista RNA-alaansa ORNA on kehittänyt in situ kimaerista antigen-reseptoria (CAR) terapiaa in situ -hoitoon, joka hyödyntää ORN-101:ää, LNP-pakkauksessa olevaa pyörimisen rinnakkaista RNA:a, säätämään immuunisoluja potilailla. ORN-101:n CAR esittää korkean ilmaisun optimoitunut IRES-elementti ohjaa. Eläinmalleissa ORN-101 osoitti aiheuttavan tumoreiden supistumisen ja tuhoutumisen, mikä viittaa siihen, että ORN-101:stä peräisin olevat anti-kanseriterapiat saattavat vaikuttaa perinteisiin CAR-T soluhoitoihin.
Lisäksi Zhang et al. arvioivat mahdollisuutta ja hoitotehoja circRNA:issa antigen-tarkkaisten T-solu reseptori (TCR)-T-hoitoissa. He suunnittelivat circRNA:ta, joka koodaa pp65-TCR-T:ta, joka kohdistuu cytomegalovirusin (CMV) pp65 epitoppiin. Lisäksi pp65-TCR osoittautui ilmaantuvan ensimmäisissä T-solussa yli 7 päivää. Lisäksi circRNA-pp65-TCR-T solut tappoivat erityisesti ja johdonmukaisesti pp65- ja HLA ilmaisevia tumorsoluja ja merkittävästi pidätti hiirien selviytymisehdot.
Nähtiin myös, että pp65 circRNA:ta transfektoimilla soluilla oli parempia immuunivasteita verrattuna lineaariseen mRNA:an.
Yaohain Bio-Pharma:n yhteensovitettu CRDMO -ratkaisu pitkälle koodaavalle RNA:lle
FI
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
