Sirkulaariset RNA:t (circRNA:t) löydettiin ensimmäisen kerran ei-koodaavina RNA:ina vuonna 1979; vasta vuonna 2015 Drosophilassa löydettiin transkriptoituja sircRNA:ita, mikä johti in vitro -circRNA:iden tutkimukseen terapeuttisia ja ennaltaehkäiseviä tarkoituksia varten.
sircRNA:t ovat itsestään laajenevia, eikä niillä siksi ole tavanomaista rakennetta, kuten 5' cap tai 3' polyA häntä. Tämä rakenne tekee niistä vakaampia ja vastustuskykyisempiä eksonukleaaseille, kuten RNaasi R:lle.
Pyöreän RNA:n (circRNA) rakenneelementit
CircRNA-synteesin templaatti-DNA sisältää tyypillisesti sisäisen ribosomin sisääntulokohdan (IRES), avoimen lukukehyksen (ORF) ja muita, jotka ovat kriittisiä in vitro -kierron kannalta. Suunnittelimme esimerkiksi plasmidin in vitro -transkripti (IVT) -templaatiksi, joka koostuu homologiavarsista, 3'-intronista, 3'-eksonista, IRES:stä, ORF:stä, 5'-eksonista ja 5'-intronista, valmistamaan sircRNA:ta itsesilmukoitumalla. menetelmiä.
Internal Ribosome Entry Site (IRES) suorittaa tärkeitä rooleja cirRNA:iden translaatiossa. Enkefalomyokardiittivirus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, ihmisen rinovirus B3 (HRV-B3) IRES ja muut IRES ovat yleisesti käytetty cirRNA:iden vitro-synteesin translaatiossa.
SircRNA:n lineaaristen prekursorien syklisointi in vivo tarjoaa tärkeän vaiheen sircRNA-synteesissä, yleensä kemiallisten, entsymaattisten ja ribosomivälitteisten itsereplikaatioreittien kautta. Alan virstanpylväänä tunnettu vuonna 1988 alkanut kemiallinen lähestymistapa circRNA:n tuotantoon ei ole enää käytössä nykyään sen korkeiden kustannusten, alhaisen tuoton, suuren sivutuotteiden määrän ja sen vuoksi, että se soveltuu vain syklisointiin. RNA:t, joiden pituus on enintään 70 nukleotidia.
Entsymaattiset menetelmät RNA:n syklisoimiseksi perustuvat bakteriofagi T4-entsyymeihin tai ribotsyymeihin, kuten T4 DNA-ligaasiin (T4 Dnl 1), T4 RNA ligaasiin 1 (T4 Rnl 1) ja T4 RNA ligaasiin 2 (T4 Rnl 2). Pyöreän RNA:n muodostamiseksi T4-bakteriofagientsyymeillä nukleosidimonofosfaatit on sijaittava RNA:n 5'-päässä ja konjugoituneena OH-ryhmään RNA:n 3'-päässä. Koska nukleosiditrifosfaatteja lisätään reaktion aikana, IVT-RNA sisältää guanosiinitrifosfaattia (GTP) 5'-päässä.
Ribotsyymit ovat RNA-sekvenssejä, jotka edistävät itsesilmukointia muuntamalla lineaariset RNA-molekyylit sircRNA:ksi ilman lisäentsyymien tarvetta. Itsekokoamisprosessi sisältää kaksi peräkkäistä transesteröintireaktiota tietyissä kohdissa sen varmistamiseksi, että halutut cirRNA-tuotteet muodostuvat. Ryhmän I intronien itsesilmukointimenetelmää, joka tunnetaan myös nimellä PIE (intron and exon encapsulation), joka mahdollistaa yli 5 kb:n cirRNA:iden tuotannon, on tutkittu laajasti ja se on osoittautunut käyttökelpoiseksi.
Circular RNA:n (circRNA) käyttö
CircRNA-rokotteet
Kuten lineaariset mRNA:t, sircRNA:t voidaan muuntaa tietyiksi proteiineiksi kohdesoluissa ja indusoida vankka humoraalinen ja sellulaarinen immuniteetti. Viime aikoina jotkut tutkimusryhmät ovat onnistuneesti kehittäneet sircRNA-rokotteita ehkäisemään COVID-19:ää. Heidän tuloksissaan ei ole vain ollut lineaaristen mRNA-rokotteiden etuja, vaan ne ovat myös ylpeillyt paremmalla stabiiliudella ja pidempään proteiiniekspression kestolla kuin lineaarisella mRNA:lla. Siksi sircRNA-rokotteet voivat indusoida riittäviä immuunivasteita jopa pienillä annoksilla.
Lisäksi jotkut tutkijat uskovat, että circRNA-rokotteet, seuraavan sukupolven mRNA:ina, voivat tulevaisuudessa muodostua tehokkaiksi työkaluiksi yleisten virus-/bakteerisairauksien ja tärkeimpien uusien tartuntatautien torjunnassa sekä syövän ja muiden sairauksien hoidossa.
CircRNA CAR / TCR-T-terapiassa
Pioneerina sirkulaarisen RNA:n alalla ORNA on kehittänyt in situ kimeeristä antigeenireseptoria (CAR) -terapiaa in situ -terapiaan, jossa käytetään ORN-101:tä, LNP-kapseloitua sirkulaarista RNA:ta, moduloimaan potilaiden immuunisoluja. ORN-101 esittelee optimoidun IRES-elementin ohjaaman CAR:n korkean ilmentymän. Eläinmalleissa ORN-101:n osoitettiin indusoivan kasvaimen suppressiota ja tuhoa, mikä viittaa siihen, että ORN-101-pohjaiset syövänvastaiset hoidot voivat häiritä tavanomaista CAR-T-soluhoitoa.
Lisäksi Zhang et ai. arvioi sircRNA:iden elinkelpoisuutta ja terapeuttista tehokkuutta antigeenispesifisissä T-solureseptori (TCR)-T-hoidoissa. He suunnittelivat pp65-TCR-T:tä koodaavan sircRNA:n, joka kohdistui sytomegaloviruksen (CMV) pp65-epitooppiin. Lisäksi pp65-TCR:n osoitetaan ilmentyvän primaarisissa T-soluissa yli 7 päivän ajan. Lisäksi circRNA-pp65-TCR-T-solut tappoivat spesifisesti ja johdonmukaisesti pp65:tä ja HLA:ta ilmentäviä kasvainsoluja ja pidensivät merkittävästi hiirten eloonjäämisaikaa.
Osoitettiin myös, että pp65-circRNA:lla transfektoidut solut osoittivat parempia immuunivasteita verrattuna lineaariseen mRNA:han.
Yaohain Bio-Pharma One-Stop CRDMO-ratkaisu pitkälle koodaavalle RNA:lle
FI
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FR
DE
EL
IT
JA
KO
EI
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
