In Vitro Synthese van mRNA
De belangrijke componenten van mRNA zijn de 5'-cap, 5'-UTR, open reading frame (ORF), 3'-UTR en poly-A staart, die essentieel zijn voor het onderhouden van de mRNA-functie. Onderzoekers hebben verschillende methoden gebruikt om mRNA-sequenties en -structuren te identificeren en te optimaliseren.
De synthese van mRNA wordt uitgevoerd op basis van in vitro transcriptie (IVT) met lineaire DNA-sjablonen, RNA-polymerasen (T3, T7 of SP6), ongewijzigde of gewijzigde nucleotiden, enzymen en geschikte reagentia.
5' Cap Modificatie
De sequenties van volwassen mRNA uit eukaryocellen tonen een 7-methylguanosine (m7G)-kap aan het 5' einde, wat de stabiliteit van mRNA en de vertaal-efficiëntie verbetert. Er zijn twee algemene methoden om mRNA in vitro te isoleren. Ten eerste kan mRNA samen met het in vitro transcript worden afgekapt door een cap-analoog van de m7GpppG-structuur (bijv., CleanCap) toe te voegen aan het IVT-systeem. Deze co-transcriptionele capping methode biedt een natuurlijke 5' capsulestructuur en verhoogt de efficiëntie van capping naar bijna 90-99%. Ten tweede kan mRNA-mapping ook worden bereikt door enzymatische reacties na de in vitro transcriptie-reactie.
PolyA Modificatie
De poly(A) staart verlengt ook de halveringstijd van mRNA in vivo en verbetert de vertaalkundigheid van mRNA. De lengte van de aangevulde poly(A) staart moet 100-300 nucleotiden zijn. Daarnaast verhoogt gemodificeerd adenosine de stabiliteit van de poly A-staart tegen celulaire RNase-degradatie. Een poly A-staart kan worden ingevoegd door in vitro transcriptrie met behulp van een DNA-sjabloon dat poly A codeert, waardoor een specifieke lengte van de poly A-sequentie ontstaat. Recombinante poly A-polymerase kan ook worden gebruikt voor enzymatische polyadenylatie na mRNA-transcriptie.
Nucleotiden Modificatie
Gemodificeerde nucleosiden kunnen de herkenning en/of activatie van patroonherkenningsreceptoren (PRR) inhiberen en de effectiviteit van mRNA-vaccins op twee volledig verschillende manieren verbeteren. De toevoeging van bepaalde chemisch gemodificeerde nucleosiden, waaronder pseudouridine (ψ), 1-methylpseudouridine (m1ψ), thiouridine (s4U) en 5-methylcytosine (m5C), kan de activatie van TLR7/8 en andere innate immuunreceptoren voorkomen, wat de immunogeniteit van mRNA aanzienlijk vermindert.
mRNA Afleveringssysteem
Om de functie van mRNA te behouden, moet het in de hostcytoplasma komen en specifieke antigenen expresseren. Een van de grootste uitdagingen bij mRNA-vaccins en therapieën ligt in het afleveren van mRNA in doelcellen met voldoende hoge translatieniveaus, wat zeer specifieke en efficiënte mRNA-afleveringssystemen vereist. Verschillende mRNA-afleveringsvectoren zijn ontwikkeld en in gebruik genomen, waaronder dendritische cellen (DC's), protamine, cationische polymeren en cationische liposomen.
Complexen van cationische lipiden met mRNA en andere preparaten kunnen samen 80-200 nm grote nanopartikels vormen, bekend als lipid nanopartikels (LNPs). Als een van de geavanceerdste mRNA-leveringssystemen bevat LNP ioniseerbare cationische lipiden, natuurlijke fosfolipiden, cholesterol en polyethyleenglycol (PEG). Verschillende RNA-vaccins en therapieën (siRNA en mRNA) goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration zijn gebaseerd op LNP-leveringssystemen.
Yaohai Bio-Pharma biedt een volledige oplossing voor RNA
Op maat gemaakte leveringen
Kwaliteit
|
Leveranties
|
Specificatie
|
Toepassingen
|
non-GMP
|
Werkzame Stof, mRNA
|
0,1~10 mg (mRNA)
|
Preclinisch onderzoek zoals celtransfectie, Ontwikkeling van analytische methoden, Pre-stabiliteitsstudies, Formulontwikkeling
|
Drug Product, LNP-mRNA
|
GMP, Steriliteit
|
Werkzame Stof, mRNA
|
10 mg~70 g
|
Investigational new drug (IND), Clinical trial authorisation (CTA), Klinische proefvoorraad, Biologics license application (BLA), Commerciële voorraad
|
Drug Product, LNP-mRNA
|
5000 flessen of voorvulde spuiten/ cartridge
|