Circular RNAs (circRNAs) werden voor het eerst ontdekt als niet-codeerende RNAs in 1979; pas in 2015 werden getranscribeerde circRNAs gevonden in Drosophila, wat heeft geleid tot het onderzoek van circRNAs in vitro voor therapeutische en preventieve doeleinden.
circRNAs breiden zich zelf uit en hebben dus geen conventionele structuur zoals een 5' cap of 3' polyA staart. Deze structuur maakt ze stabiel en resistent tegen exonucleasen zoals RNase R.
Structuurelementen van Circular RNA (circRNA)
De template DNA voor circRNA-synthese bevat meestal een intern ribosome entry site (IRES), open reading frame (ORF) en andere elementen die cruciaal zijn voor de in vitro circulatie. Bijvoorbeeld, we hebben een plasmid ontworpen als in vitro transcript (IVT)-template, dat bestaat uit homologiearmen, 3’ intron, 3’ exon, IRES, ORF, 5’ exon en 5’ intron, om circRNA voor te bereiden door zelf-splicing methoden.
Het Interne Ribosome Entry Site (IRES) speelt belangrijke rollen in de vertaling van cirRNAs. Het IRES van het encephalomyocarditisvirus (EMCV), het IRES van coxsackievirus B3 (CVB3), het IRES van human rhinovirus B3 (HRV-B3) en andere IRES worden vaak gebruikt voor de vertaling van de vitro synthese van cirRNAs.
De in vivo cyclisatie van circRNA-lineaire precursor biedt een belangrijke stap in de circRNA-synthese, meestal via chemische, enzymatische en ribosoom-gemediate zelfreplicatiepaden. De chemische methode voor circRNA-productie, ontwikkeld in 1988, wordt vandaag de dag niet meer gebruikt vanwege de hoge kosten, lage opbrengst, veel bijproducten en het feit dat deze methode alleen geschikt is voor de cyclisatie van RNAs tot maximaal 70 nucleotiden in lengte.
Enzymatische methoden voor het cycliseren van RNA zijn gebaseerd op bacteriofage T4 enzymen of ribozymen zoals T4 DNA ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA ligase 1 (T4 Rnl 1) en T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl 2). Om circulaire RNA te vormen met T4 bacteriofage enzymen, moeten nucleoside monofosfaatgroepen zich bevinden aan het 5' einde en gekoppeld zijn aan de OH groep aan het 3' einde van de RNA. Aangezien nucleoside trifosfaatgroepen tijdens de reactie worden toegevoegd, bevat IVT RNA guanosine trifosfaat (GTP) aan het 5’ einde.
Ribozymen zijn RNA-sequenties die zelf-splicing stimuleren door lineaire RNA-moleculen in circRNA om te zetten zonder extra enzymen nodig te hebben. Het zelf-assemblageproces omvat twee opeenvolgende transesterificatie-reacties op specifieke posities om ervoor te zorgen dat de gewenste cirRNA-producten ontstaan. De groep I intron zelf-splicing methode, ook bekend als PIE (intron en exon encapsulatie), die toelaat de productie van cirRNAs langer dan 5 kb, is uitgebreid bestudeerd en heeft bewezen nuttig te zijn.
Toepassing van Circulaire RNA (circRNA)
CircRNA Vaccins
Net als lineaire mRNA's kunnen circRNA's in doelwitcellen omgezet worden in bepaalde eiwitten en een sterke humorale en celmatige immuniteit induceren. Onlangs hebben sommige onderzoeksgroepen succesvol circRNA-vaccins ontwikkeld om COVID-19 te voorkomen. Hun resultaten bezitten niet alleen de voordelen van lineaire mRNA-vaccins, maar ook een betere stabiliteit en een langere duur van eiwitexpressie dan lineaire mRNA. Daardoor kunnen circRNA-vaccins voldoende immuunreacties induceren zelfs bij lage doseringen.
Daarnaast denken sommige onderzoekers dat circRNA-vaccins, als volgende generatie mRNA's, in de toekomst effectieve hulpmiddelen kunnen worden om algemene virale/bacteriële ziekten en belangrijke nieuwe infectieuze ziekten te bestrijden, evenals voor het behandelen van kanker en andere aandoeningen.
CircRNA in CAR/TCR-T therapie
Als pionier op het gebied van circulaire RNA ontwikkelt ORNA in situ chimeric antigen receptor (CAR) therapie voor in situ therapie die gebruikmaakt van ORN-101, een LNP-geëncapsuleerde circulaire RNA, om immuuncellen bij patiënten aan te sturen. ORN-101 toont een hoge expressie van de CAR aangedreven door een geoptimaliseerd IRES-element. In diermodellen werd aangetoond dat ORN-101 tumoronderdrukking en -vernietiging induceert, wat suggereert dat anticancetherapieën gebaseerd op ORN-101 kunnen interfereren met conventionele CAR-T-celtherapie.
Daarnaast hebben Zhang et al. de haalbaarheid en therapeutische effectiviteit van circulaire RNAs in antigen-specifieke T-cell receptor (TCR)-T therapieën geëvalueerd. Ze ontwierpen een circulaire RNA die pp65-TCR-T codeert, gericht op het pp65-epitope van cytomegalovirus (CMV). Bovendien is aangetoond dat pp65-TCR wordt uitgedrukt op primaire T-cellen gedurende meer dan 7 dagen. Daarnaast doden circRNA-pp65-TCR-T cellen specifiek en consistent pp65-en HLA-uitdrukkende tumorencellen en verlengen ze aanzienlijk de levensduur van muizen.
Er werd ook aangetoond dat cellen die waren getransfereerd met pp65 circRNA betere immuunreacties vertoonden in vergelijking met lineaire mRNA.
Yaohai’s Bio-Pharma Al-in-Één CRDMO-oplossing voor Long-Coding RNA
NL
EN
AR
HR
CS
DA
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
