Circulaire RNA's (circRNA's) werden voor het eerst ontdekt als niet-coderende RNA's in 1979; Pas in 2015 werden getranscribeerde circRNA's gevonden in Drosophila, wat leidde tot de studie van in vitro circRNA's voor therapeutische en preventieve doeleinden.
circRNA's zijn zelfexpanderend en hebben daarom geen conventionele structuur zoals een 5'-kap of 3'-polyA-staart. Deze structuur maakt ze stabieler en resistenter tegen exonucleasen zoals RNase R.
Structuurelementen van circulair RNA (circRNA)
Het matrijs-DNA voor circRNA-synthese omvat doorgaans een interne ribosoomingangsplaats (IRES), een open leesraam (ORF) en andere die cruciaal zijn voor de in vitro circulatie. We hebben bijvoorbeeld een plasmide ontworpen als in vitro transcript (IVT)-sjabloon, dat bestaat uit homologie-armen, 3'-intron, 3'-exon, IRES, ORF, 5'-exon en 5'-intron, om circRNA te bereiden door zelfsplitsing methoden.
Internal Ribosome Entry Site (IRES) speelt een belangrijke rol bij de vertaling van cirRNA's. Encefalomyocarditisvirus (EMCV) IRES, coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, menselijk rhinovirus B3 (HRV-B3) IRES en andere IRES zijn vaak gebruikt voor de vertaling van de vitrosynthese van cirRNA's
In vivo cyclisatie van lineaire circRNA-voorlopers vormt een belangrijke stap in de circRNA-synthese, meestal via chemische, enzymatische en ribosoom-gemedieerde zelfreplicatieroutes. De chemische aanpak voor de productie van circRNA, die in 1988 ontstond en bekend staat als een mijlpaal in het veld, wordt tegenwoordig niet meer gebruikt vanwege de hoge kosten, de lage opbrengst, het grote aantal bijproducten en het feit dat deze alleen geschikt is voor cyclisering. RNA's met een lengte tot 70 nucleotiden.
Enzymatische methoden voor het cycliseren van RNA zijn gebaseerd op bacteriofaag T4-enzymen of ribozymen zoals T4 DNA-ligase (T4 Dnl 1), T4 RNA-ligase 1 (T4 Rnl 1) en T4 RNA-ligase 2 (T4 Rnl 2). Om circulair RNA te vormen door T4-bacteriofaag-enzymen, moeten nucleosidemonofosfaten zich aan het 5'-uiteinde bevinden en aan de OH-groep aan het 3'-uiteinde van het RNA worden geconjugeerd. Omdat nucleosidetrifosfaten tijdens de reactie worden toegevoegd, bevat IVT-RNA guanosinetrifosfaat (GTP) aan het 5'-uiteinde.
Ribozymen zijn RNA-sequenties die zelfsplitsing bevorderen door lineaire RNA-moleculen om te zetten in circRNA zonder dat er extra enzymen nodig zijn. Het zelfassemblageproces omvat twee opeenvolgende transesterificatiereacties op specifieke plaatsen om ervoor te zorgen dat de gewenste cirRNA-producten worden gevormd. De groep I intron self-splicing-methode, ook bekend als PIE (intron en exon encapsulation), die de productie van cirRNA's langer dan 5 kb mogelijk maakt, is uitgebreid bestudeerd en nuttig gebleken.
Toepassing van circulair RNA (circRNA)
CircRNA-vaccins
Net als lineaire mRNA's kunnen circRNA's worden omgezet in bepaalde eiwitten in doelcellen en de robuuste humorale en cellulaire immuniteit induceren. Onlangs zijn er enkele onderzoeksteams die met succes circRNA-vaccins hebben ontwikkeld om COVID-19 te voorkomen. Hun resultaten hebben niet alleen de voordelen van lineaire mRNA-vaccins opgeleverd, maar ook een betere stabiliteit en langere duur van eiwitexpressie dan lineair mRNA. Daarom kunnen circRNA-vaccins zelfs bij lage doses adequate immuunreacties veroorzaken.
Bovendien denken sommige onderzoekers dat circRNA-vaccins, als mRNA's van de volgende generatie, in de toekomst effectieve instrumenten kunnen worden voor de bestrijding van veel voorkomende virale/bacteriële ziekten en belangrijke opkomende infectieziekten, evenals voor de behandeling van kanker en andere ziekten.
CircRNA in CAR / TCR-T-therapie
Als pionier op het gebied van circulair RNA heeft ORNA in situ chimere antigeenreceptor (CAR)-therapie ontwikkeld voor in situ therapie waarbij gebruik wordt gemaakt van ORN-101, een in LNP ingekapseld circulair RNA, om immuuncellen bij patiënten te moduleren. ORN-101 presenteert een hoge expressie van de CAR, aangedreven door een geoptimaliseerd IRES-element. In diermodellen werd aangetoond dat ORN-101 tumoronderdrukking en -vernietiging induceert, wat suggereert dat op ORN-101 gebaseerde antikankertherapieën de conventionele CAR-T-celtherapie kunnen verstoren.
Bovendien hebben Zhang et al. evalueerde de levensvatbaarheid en therapeutische werkzaamheid van circRNA's in antigeenspecifieke T-celreceptor (TCR) -T-therapieën. Ze ontwierpen een circRNA dat codeert voor pp65-TCR-T en zich richt op het pp65-epitoop van het cytomegalovirus (CMV). Bovendien is aangetoond dat pp65-TCR gedurende meer dan 7 dagen tot expressie wordt gebracht op primaire T-cellen. Bovendien doodden circRNA-pp65-TCR-T-cellen specifiek en consistent tumorcellen die pp65 en HLA tot expressie brengen en verlengden ze de overlevingstijd van muizen aanzienlijk.
Er werd ook aangetoond dat cellen getransfecteerd met pp65-circRNA betere immuunresponsen vertoonden vergeleken met lineair mRNA.
Yaohai's Bio-Pharma One-Stop CRDMO-oplossing voor lang coderend RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NEE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
