Durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) basierte Peptidkarten werden große Mengen an Informationen zur primären und höheren Struktur von nativen und rekombinanten Proteinen bereitgestellt, einschließlich Aminosäuresequenzabdeckung, posttranslationalen Modifikationen (PTMs, z. B. Glykosylierung, Oxidation, Deamidation), Disulfidbrücken usw.
Yaohai Bio-Pharma bietet Peptidkartierungsanalysedienste für Ihr Zielprotein mittels LC-MS an, um Ihre Forschung zur Proteinstruktur zu beschleunigen.
Wir waren in der Charakterisierung der Proteinstruktur verschiedener großer Moleküle involviert, darunter Rekombinante Subeinheitsimpfstoffe, Nanobody/VHHs/Einzeldomänen-Antikörper (sdAbs), Antikörperfragmente, Hormone/Peptide, Interleukine, Wachstumsfaktoren (GF), Enzyme, Kollagene usw.
Regulatorische Anforderungen für Peptidkartierung
ICHQ6B-Leitfaden empfiehlt: „Die gezielte Zerlegung des Produkts in diskrete Peptide wird mit geeigneten Enzymen oder Chemikalien durchgeführt, und die resultierenden Peptidfragmente werden mittels HPLC oder anderer angemessener analytischer Verfahren analysiert. Peptidfragmente sollten soweit wie möglich mithilfe von Techniken wie Aminosäurezusammensetzungsanalyse, N-Terminal-Sequenzierung oder Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. Die Peptidkarten des Wirkstoffs oder des Arzneimittelprodukts (DP) unter Verwendung einer angemessen validierten Methode ist eine oft verwendete Methode zur Bestätigung der gewünschten Produktstruktur für den Chargenfreigabe.“
Analytische Methoden
| Analyse |
Methoden |
| Peptidkarten |
Protease-Degradation und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) |
Analytisches Verfahren
1. Reduktion und Alkylierung
Das Ziel ist es, Disulfidbrücken zu reduzieren und das entstehende freie Thiol zu blockieren. Die Reduktion der Disulfidbrücken hilft dabei, die Proteinstuktur zu öffnen, was die proteolytische Verdauung effizienter macht. Dieser Schritt wird auch die Brücken zwischen den Ketten bei mehrfach verketteten Proteinen brechen, die Disulfidbrücken haben, die die Ketten verbinden (z. B. monoklonale Antikörper, mAbs).
2. Verdauung des Proteins mit Enzymen
Das Ziel ist es, das Protein in Peptide zu zerlegen. Wir wählen die Enzyme auf Basis der theoretischen Sequenz des Proteins und dem Wissen über die theoretische Verdauung des Proteins durch Enzyme. Auf diese Weise sollte die beste Peptidkartenanalyse resultieren.
3. Analyse der verdauten Peptide Verwendung von On-line Reverse Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Ultraviolett- (UV) und Elektrospray-Massenspektrometrie-Erkennung (LC/ES-MS).
Peptidtrennung basierend auf Polarität mittels LC (Reverse Phase-LC)
Während das Peptid vom LC-Spalte eluiert, generiert der Massenspektrometer Masseinformationen zusammen mit Fragmentionsinformationen, was uns ermöglicht, die Sequenzinformation zu bestimmen. Wir nutzen die Sequenzinformation, um die Peptididentität zu bestätigen und primäre Informationen bereitzustellen.
Wir können auch die Fragmentierungsinformationen von den Peptiden generieren, während sie von der LC-Spalte in die Massenspektrometerquelle eintreten. Je nach Anforderungen der Studie handelt es sich entweder um selektives LC-MS/MS oder nicht-selektives, was als eine Form von Tandem-MS betrachtet werden kann.
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