Der Anteil der N-Glykosylierungsstellen ist eine physiologische Eigenschaft von Glykoproteinen und erzeugt hauptsächlich N-Glykan. Der Dienstleistungsbereich zur Analyse des Anteils der N-Glykosylierungsstellen von Yaohai Bio-Pharma wird durch Verdauung, Freisetzung, Anreicherung und Analyse unter Verwendung von Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) durchgeführt.
Wir waren in der Charakterisierung der Proteinstruktur verschiedener großer Moleküle involviert, darunter Rekombinante Subeinheitsimpfstoffe, Nanobody/VHHs/Einzeldomänen-Antikörper (sdAbs), Antikörperfragmente, Hormone/Peptide, Interleukine, Wachstumsfaktoren (GF), Enzyme, Kollagene usw.
Regulierungsanforderungen für den Anteil der N-Glykosylierungsstellen
Gemäß der ICH Q6B-Richtlinie wird „bei Glykoproteinen der Kohlenhydratgehalt (neutrale Zucker, Aminozucker und Sialinsäuren) bestimmt. Darüber hinaus werden die Struktur der Kohlenhydratketten, das Oligosaccharidmuster (Antennenprofil) und die Glicosylierungsstelle(n) der Polypeptidkette soweit wie möglich analysiert.“
Analytische Methode
| Analyse |
Methoden |
| Besetzung von N-Glykosylierungsstellen |
LC-MS nach Deglykosylase- und Proteasenverdauung |
Verfahren
1. Proteinverdauung von Proteinen zur Erzeugung kleiner Peptidfragmente.
2. Freisetzung von N-Glykanen mittels Endoglycosidase H oder PNGase F. Endoglycosidase H spaltet den Bond zwischen den beiden GlcNAc-Residuen im Kern der N-verknüpften Glykane, während PNGase F eine Glykoamidase ist, die den Bond zwischen GlcNAc und Asn durchtrennt, wodurch die gesamte Zuckerkette freigesetzt wird und Asn in Asp mit einer Massenzunahme von 1-Da umgewandelt wird.
3. Anreicherung von N-Glycopeptiden über HILIC (Hydrophile Interaktionsflüssigchromatographie)
4. Analyse der Besetzung von N-verknüpften Glykosylierungsstellen mittels LC-ESI-MS/MS.
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