Auf Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) basierende Peptid-Mapping-Daten liefern umfangreiche Informationen zur Primär- und Oberstruktur nativer und rekombinanter Proteine, einschließlich der Aminosäuresequenzabdeckung, posttranslationalen Modifikationen (PTMs, z. B. Glykosylierung, Oxidation, Deamidierung), Disulfidbindungen usw.
Yaohai Bio-Pharma bietet Peptide-Mapping-Analysedienste für Ihr Zielprotein mittels LC-MS an, um Ihre Forschung zur Proteinstruktur zu beschleunigen.
Wir waren an der Proteinstrukturcharakterisierung verschiedener großer Moleküle beteiligt, darunter rekombinante Untereinheitenimpfstoffe, Nanobodies/VHHs/Einzeldomänenantikörper (sdAbs), Antikörperfragmente, Hormone/Peptide, Zytokine, Wachstumsfaktoren (GF), Enzyme, Kollagene usw.
Regulatorische Anforderungen für das Peptide Mapping
Die Leitlinie ICHQ6B empfiehlt: „Die selektive Fragmentierung des Produkts in einzelne Peptide erfolgt mithilfe geeigneter Enzyme oder Chemikalien und die resultierenden Peptidfragmente werden mit HPLC oder einem anderen geeigneten Analyseverfahren analysiert. Peptidfragmente sollten so weit wie möglich mithilfe von Techniken wie Aminosäurezusammensetzungsanalyse, N-terminaler Sequenzierung oder Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. Die Peptidkartierung des Wirkstoffs oder Arzneimittelprodukts (DP) mithilfe einer entsprechend validierten Methode ist eine Methode, die häufig verwendet wird, um die gewünschte Produktstruktur für die Chargenfreigabe zu bestätigen.“
Analytische Methoden
| Analyse |
Methoden |
| Peptidkartierung |
Proteaseverdauung und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) |
Analytisches Verfahren
1. Reduktion und Alkylierung
Der Zweck besteht darin, Disulfidbrücken zu reduzieren und das erzeugte freie Thiol zu blockieren. Die Reduzierung von Disulfidbrücken hilft, die Proteinstruktur zu öffnen, wodurch die proteolytische Verdauung effizienter wird. Dieser Schritt bricht auch die Brücken zwischen den Ketten bei mehrkettigen Proteinen auf, die Disulfidbrücken aufweisen, die die Ketten verbinden (z. B. monoklonale Antikörper, mAbs).
2. Verdauung des Proteins durch Enzyme
Ziel ist es, das Protein in Peptide zu zerlegen. Wir haben die Enzyme auf der Grundlage der theoretischen Sequenz des Proteins und des Wissens über die theoretische Verdauung des Proteins durch Enzyme ausgewählt. Die Auswahl der Enzyme auf diese Weise sollte zur besten Peptidmapping-Analyse führen.
3. Analyse der verdauten Peptide Verwendung von Online-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Ultraviolett- (UV) und Elektrospray-Massenspektrometrie-Detektion (LC/ES-MS).
Polaritätsbasierte Peptidtrennung mittels LC (Reverse Phase-LC)
Wenn das Peptid aus der LC-Säule eluiert, generiert das Massenspektrometer Masseninformationen zusammen mit Fragmentioneninformationen, die es uns ermöglichen, die Sequenzinformationen zu ermitteln. Wir verwenden die Sequenzinformationen, um die Peptididentität zu bestätigen und Primärinformationen bereitzustellen.
Wir können auch Fragmentierungsinformationen aus den Peptiden generieren, wenn diese von der LC-Säule in die Massenspektrometerquelle gelangen. Je nach den Anforderungen der Studie handelt es sich dabei entweder um selektive LC-MS/MS oder um nicht selektive LC-MS, was als eine Form von Tandem-MS betrachtet werden kann.
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