Die Besetzung von N-Glykosylierungsstellen ist ein physiologisches Merkmal von Glykoproteinen und produziert hauptsächlich N-Glykan. Der Service zur Analyse der Besetzung von N-Glykosylierungsstellen von Yaohai Bio-Pharma wird durch Verdauung, Freisetzung, Anreicherung und Analyse mittels Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) durchgeführt.
Wir waren an der Proteinstrukturcharakterisierung verschiedener großer Moleküle beteiligt, darunter rekombinante Untereinheitenimpfstoffe, Nanobodies/VHHs/Einzeldomänenantikörper (sdAbs), Antikörperfragmente, Hormone/Peptide, Zytokine, Wachstumsfaktoren (GF), Enzyme, Kollagene usw.
Regulatorische Anforderungen für die Belegung von N-Glykosylierungsstellen
Gemäß der Leitlinie ICH Q6B wird „bei Glykoproteinen der Kohlenhydratgehalt (Neutralzucker, Aminozucker und Sialinsäuren) bestimmt. Darüber hinaus werden die Struktur der Kohlenhydratketten, das Oligosaccharidmuster (Antennenprofil) und die Glykosylierungsstelle(n) der Polypeptidkette so gut wie möglich analysiert.“
Analytische Methode
| Analyse |
Methoden |
| Besetzung der N-Glykosylierungsstelle |
LC-MS nach Deglycosylase- und Proteaseverdau |
Verfahren
1. Proteinverdauung von Proteinen zur Erzeugung kleiner Peptidfragmente.
2. Freisetzung von N-Glycan mithilfe von Endoglycosidase H oder PNGase F. Endoglycosidase H spaltet die Bindung zwischen den beiden GlcNAc-Resten im Kern von N-gebundenen Glykanen, während PNGase F eine Glykoamidase ist, die die Bindung zwischen GlcNAc und Asn durchtrennt, die gesamte Zuckerkette freisetzt und Asn mit einer Massenzunahme von 1 Da in Asp umwandelt.
3. N-Glycopeptid-Anreicherung mittels HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
4. Analyse der Belegung der N-Glykosylierungsstellen mittels LC-ESI-MS/MS.
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