ARN-urile circulare (circRNAs) au fost descoperite pentru prima dată ca ARN-uri necodificatoare în 1979; Abia în 2015 s-au găsit circRNA transcrise în Drosophila, ceea ce a condus la studiul circRNA in vitro în scopuri terapeutice și preventive.
CirRNA-urile sunt auto-expandibile și, prin urmare, nu au o structură convențională, cum ar fi un capac 5' sau o coadă poliA 3'. Această structură îi face mai stabili și mai rezistenți la exonucleaze precum RNaza R.
Elemente de structură ale ARN circular (ARNcirc)
ADN-ul șablon pentru sinteza circARN include de obicei site-ul intern de intrare în ribozom (IRES), cadru deschis de citire (ORF) și altele care sunt critice pentru circulația in vitro. De exemplu, am proiectat o plasmidă ca șablon de transcriere in vitro (IVT), care constă din brațe de omologie, 3' intron, 3' exon, IRES, ORF, 5' exon și 5' intron, pentru a prepara circARN prin auto-splicing. metode.
Situl de intrare intern al ribozomului (IRES) îndeplinește roluri importante în traducerea cirRNA-urilor. Virusul encefalomiocarditei (EMCV) IRES, virusul coxsackie B3 (CVB3) IRES, rinovirusul uman B3 (HRV-B3) IRES și alte IRES au fost utilizate în mod obișnuit pentru traducerea sintezei vitro a cirRNAs
Ciclizarea in vivo a precursorilor liniari de circARN oferă un pas important în sinteza circARN, de obicei prin căi de auto-replicare chimice, enzimatice și mediate de ribozomi. Cunoscută ca o piatră de hotar în domeniu, abordarea chimică pentru producția de ARN-circn, apărută în 1988, nu mai este folosită astăzi din cauza costului ridicat, randamentului scăzut, numărului mare de produse secundare și faptului că este potrivită doar pentru ciclizare. ARN de până la 70 de nucleotide lungime.
Metodele enzimatice pentru ciclizarea ARN-ului se bazează pe enzime bacteriofage T4 sau ribozime cum ar fi T4 ADN ligaza (T4 Dnl 1), T4 ARN ligaza 1 (T4 Rnl 1) și T4 ARN ligaza 2 (T4 Rnl 2). Pentru a forma ARN circular de către enzimele bacteriofage T4, monofosfații nucleozidici trebuie să fie localizați la capătul 5’ și conjugați cu gruparea OH la capătul 3’ al ARN-ului. Deoarece trifosfații nucleozidici sunt adăugați în timpul reacției, ARN-ul IVT conține trifosfat de guanozină (GTP) la capătul 5’.
Ribozimele sunt secvențe de ARN care promovează auto-splicing prin conversia moleculelor de ARN liniar în circARN fără a fi nevoie de enzime suplimentare. Procesul de auto-asamblare implică două reacții consecutive de transesterificare la locuri specifice pentru a se asigura că se formează produsele cirARN dorite. Metoda de auto-splicing intron de grup I, cunoscută și sub numele de PIE (încapsulare intron și exon), care permite producerea de cirARN mai lungi de 5 kb, a fost studiată pe larg și s-a dovedit utilă.
Aplicarea ARN circular (ARNcirc)
Vaccinuri CircRNA
La fel ca ARNm-urile liniare, ARNm-urile pot fi convertite în anumite proteine în celulele țintă și pot induce imunitatea umorală și celulară robustă. Recent, există câteva echipe de cercetare care au dezvoltat cu succes vaccinuri circRNA pentru a preveni COVID-19. Rezultatele lor nu numai că au avut beneficiile vaccinurilor ARNm liniar, dar s-au lăudat și cu o stabilitate mai bună și o durată mai lungă de exprimare a proteinei decât ARNm liniar. Prin urmare, vaccinurile circARN pot induce răspunsuri imune adecvate chiar și la doze mici.
În plus, unii cercetători cred că vaccinurile circARN, ca ARNm de generație următoare, pot deveni instrumente eficiente în viitor pentru combaterea bolilor virale/bacteriene comune și a bolilor infecțioase majore emergente, precum și pentru tratamentul cancerului și a altor boli.
CircARN în terapia CAR / TCR-T
Ca pionier în domeniul ARN circular, ORNA a dezvoltat terapia in situ cu receptorul antigen himeric (CAR) pentru terapia in situ care utilizează cu ORN-101, un ARN circular încapsulat în LNP, pentru a modula celulele imune la pacienți. ORN-101 prezintă o expresie ridicată a CAR condusă de un element IRES optimizat. În modelele animale, s-a demonstrat că ORN-101 induce supresia și distrugerea tumorii, sugerând că terapiile anticancer bazate pe ORN-101 pot interfera cu terapia convențională cu celule CAR-T.
În plus, Zhang și colab. a evaluat viabilitatea și eficacitatea terapeutică a circARN-urilor în terapiile cu receptorul de celule T antigen-specific (TCR)-T. Ei au proiectat un circARN care codifică pp65-TCR-T care vizează epitopul pp65 al citomegalovirusului (CMV). În plus, s-a demonstrat că pp65-TCR este exprimat pe celulele T primare timp de peste 7 zile. În plus, celulele circRNA-pp65-TCR-T au ucis în mod specific și constant celulele tumorale care exprimă pp65 și HLA și au prelungit semnificativ timpul de supraviețuire al șoarecilor.
S-a demonstrat, de asemenea, că celulele transfectate cu ARNm pp65 au prezentat răspunsuri imune mai bune în comparație cu ARNm liniar.
Soluția CRDMO Bio-Pharma One-Stop de la Yaohai pentru ARN cu codificare lungă
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NU
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
