RNA-urile circulare (circRNA) au fost descoperite pentru prima dată ca RNA-uri necodificatoare în 1979; nu a fost până în 2015 că s-au găsit circRNA transcrise în Drosophila, ceea ce a dus la studiul circRNA-urilor in vitro cu scop terapeutic și preventiv.
circRNA-urile se extind pe ele însine și prin urmare nu au o structură convențională, cum ar fi un cap de 5' sau o coadă polyA de 3'. Această structură le face mai stabilizate și rezistente la exonucleazele precum RNase R.
Elemente structurale ale RNA-ului circular (circRNA)
DNA-ul templet pentru sinteza circRNA-ului include, în mod tipic, un sit intern de intrare a ribozomului (IRES), un cadru deschis de citire (ORF) și altele care sunt critice pentru circulația in vitro. De exemplu, am conceput un plasmid ca templet pentru transcriptarea in vitro (IVT), care constă din brațe de omologie, intron de 3', exon de 3', IRES, ORF, exon de 5' și intron de 5', pentru a pregăti circRNA prin metode de autosplicing.
Locul Intern de Intrare a Ribosomului (IRES) îndeplinește roluri importante în traducerea cirRNAs. IRES al virusului Encephalomyocarditis (EMCV), IRES al virusului coxsackie B3 (CVB3), IRES al virusului uman rhinovirus B3 (HRV-B3) și alte IRES au fost folosite frecvent pentru traducerea sintezei in vitro a cirRNAs.
Ciclizarea in vivo a precursorilor liniari ai circRNA reprezintă un pas important în sinteza circRNA, de obicei prin căile chimice, enzymatice și autoreplicarea mediata de ribosom. Cunoscut ca o etapă semnificativă în domeniu, abordarea chimică pentru producerea circRNA, care a apărut în 1988, nu este mai utilizată astăzi din cauza costurilor ridicate, rendimentului scăzut, numărului mare de produse secundare și faptului că este potrivită doar pentru ciclizarea RNAs de până la 70 de nucleotidi în lungime.
Metodele enzymatice pentru ciclizarea RNA sunt bazate pe enzyme ale bacteriofagului T4 sau ribozime, cum ar fi ligaza DNA T4 (T4 Dnl 1), ligaza RNA T4 1 (T4 Rnl 1) și ligaza RNA T4 2 (T4 Rnl 2). Pentru a forma RNA circular cu enzymele bacteriofagului T4, monofosfatul de nucleozide trebuie să se afle la extremitatea 5' și să fie conjugat grupului OH de la extremitatea 3' a RNA. Deoarece trifosfatul de nucleozide este adăugat în timpul reacției, RNA-ul IVT conține guanosin trifosfat (GTP) la extremitatea 5’.
Ribozimele sunt secvențe de RNA care promovează autosplicing-ul prin convertirea moleculelor liniare de RNA în circRNA fără nevoia de enzime suplimentare. Procesul de autoasamblare implică două reacții consecutive de transesterificare la site-uri specifice pentru a se asigura că produsele dorite de cirRNA sunt formate. Metoda autosplicing-ului intronului de tip I, cunoscută și ca PIE (encapsulation al intronului și exonului), care permite producerea de circRNA mai lungi de 5 kb, a fost studiată extensiv și s-a dovedit utilă.
Aplicarea RNA Circular (circRNA)
Vaccinuri circRNA
La fel ca și mRNA-urile liniare, circRNA-urile pot fi transformate în anumite proteine în celulele țintă și pot indusa o imunitate umorală și celulară puternică. Recent, unele echipe de cercetare au reușit să dezvolte vaccinuri circRNA pentru a preveni COVID-19. Rezultatele nu numai că au avut beneficiile vaccinurilor cu mRNA liniar, dar au arătat și o stabilitate mai bună și o durată mai lungă a expresiei proteicelor decât mRNA-ul liniar. Prin urmare, vaccinurile circRNA pot induce răspunsuri imune adecvate chiar la doze mici.
În plus, unii cercetători consideră că vaccinurile circRNA, ca fiind mRNA-urile următoare generație, pot deveni instrumente eficiente în viitor pentru combaterea bolilor virale/bacteriene comune și ale principalelor boli infecțioase emergente, precum și pentru tratamentul cancerului și al altor boli.
CircRNA în Terapia CAR/TCR-T
Ca și pionier în domeniul RNA circular, ORNA dezvoltă terapia cu receptor antigenic hibrid (CAR) in situ pentru terapie in situ, care utilizează ORN-101, un RNA circular incapsulat în LNP, pentru a modula celulele imune ale pacienților. ORN-101 prezintă o exprimare ridicată a CARului, condusă de un element IRES optimizat. În modele animale, ORN-101 a demonstrat că induce suprimarea și distrugerea tumorii, sugerezând că terapiile anticancer bazate pe ORN-101 ar putea să intervină în terapia CAR-T celulară convențională.
De asemenea, Zhang et al. au evaluat viabilitatea și eficacitatea terapeutică a circRNA-urilor în terapiile cu receptor T-celular (TCR) specific antigenului. Ei au proiectat un circRNA codificând pp65-TCR-T care ținta epitopul pp65 al citomegalovirusului (CMV). De asemenea, s-a demonstrat că pp65-TCR este exprimat pe celulele T primare timp de peste 7 zile. De asemenea, celulele circRNA-pp65-TCR-T au ucis specific și consistent celule tumorale care exprimau pp65 și HLA și au prelungit semnificativ timpul de supraviețuire al muștilor.
De asemenea, s-a arătat că celulele transfectate cu pp65 circRNA au prezentat răspunsuri imune mai bune față de mRNA liniar.
Soluția Integrală de CRDMO pentru RNA cu Codificare Lungă a Yaohai Bio-Pharma
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
