Značaj razvoja upstream procesa
Upstream proces (USP), poznat i kao proces fermentacije, jedna je od početnih faza bioprocesiranja uzvodno. Proces mikrobne fermentacije ključan je za kulturu stanica visoke gustoće i egzogenu ekspresiju gena, što izravno utječe na prinos i cijenu bioloških lijekova.
U ranim fazama razvoja bioloških lijekova (pretklinička ili faza 1/2), fokus je na razvoju skalabilnih procesa bez životinja sa srednjim prinosom i ispunjavanjem svih standarda kvalitete proizvoda.
Dok smo u kasnim fazama (faza 3 ili komercijalna), usredotočit ćemo se na prinos, robusnost, skalabilnost i ponovljivost, stvarajući troškovno učinkovit proces. Aktivnosti koje se bave ovim pitanjima su karakterizacija procesa i studije validacije procesa. U međuvremenu se tipično primjenjuju alati za kvalitetu prema dizajnu (QbD) i dizajn eksperimenata (DoE).
Ključne riječi: razvoj procesa, optimizacija i validacija, proces fermentacije, fermentacija mikrobnih stanica, bakterijska fermentacija, kvasna fermentacija, fermentacija visoke gustoće, fermentacija proizvedenog soja
Primjena: Biofarmaceutska industrija, humana medicina, medicina za životinje, cjepiva, rekombinantni biološki lijekovi velikih molekula, rekombinantni biološki lijekovi, biološki reagens
USP rješenja tvrtke Yaohai Bio-Pharma
Koristeći više od 10 godina iskustva mikrobne fermentacije, Yaohai Bio-Pharma ima stručnost da pomogne u rješavanju izazova procesa fermentacije. Možemo brzo uspostaviti strategije fermentacije visoke gustoće za Escherichia coli (E. coli) periplazmička sekrecija, intracelularna ekspresija topljivih ili inkluzijskih tjelešaca i ekspresija kvasca izvanstanična ili intracelularna.
Naše dostupne opće usluge razvoja fermentacije uključuju:
- Dizajn procesa fermentacije izveden u malom opsegu od 7L u šaržnom načinu rada
- Validacija trošaržnog procesa u fermentorima od 7L
- Međuprocesna skala do 30L/70L
Možemo fleksibilno izvesti optimizaciju s više parametara kako bismo postigli željeni prinos ili udio, koristeći faktor jednokratnog povećanja (OTAF) ili dizajn eksperimenta (DoE).
Ključni parametri fermentacije navedeni su kako slijedi:
Sastavi fermentacijskih medija bez životinjskog podrijetla
Bez antibiotika ili ne, volumen inokuluma
Temperatura rasta, pH, razina otopljenog kisika (DO).
Način hranjenja (npr. šaržno hranjenje)
Koncentracija induktora (npr. IPTG, metanol), točka indukcije (vlažna težina stanice/OD600),
Temperatura indukcije, vrijeme indukcije
i tako dalje
Pojedinosti usluge
| Usluge |
Tijek procesa |
| Uzgoj u boci za mućkanje (500 mL) |
Priprema medija bez životinja → Uzgoj mikrobnog sjemena → Uzgoj u mućkalici → Indukcija → Žetva |
| Uzgoj u fermentoru (7 L) |
Priprema medija bez životinja → Uzgoj mikrobnog sjemena → Stanična fermentacija visoke gustoće u bioreaktoru od 7 L → Indukcija → Žetva |
| Kontrola kvalitete proteina/peptida |
Predtretman Intracelularna topljiva ekspresija: sakupljanje mikrobnih stanica i resuspenzija → Ultrazvučno drobljenje → Uklanjanje ostataka stanica → Ekspresija sirovog ekstrakta inkluzijskih tijela: sakupljanje mikrobnih stanica i resuspenzija → Ultrazvučno drobljenje → priprema inkluzijskih tijela→ Sirovi ekstrakt Izvanstanična topiva ekspresija: prikupljanje supernatanta kulture → Koncentracija i pufer izmjena → Analiza kvalitete sirovog ekstrakta Sirovi ekstrakt kao uzorak → Analiza ciljanog proteina pomoću SDS PAGE ili Western blotting (WB) |
| Kontrola kvalitete plazmida |
Predtretman i analiza kvalitete Ekstrakcija plazmida → Analiza DNK elektroforezom u agaroznom gelu |
Case study
Naš kupac nas je naručio da povećamo ciljni prinos polipeptidnog hormona s 8 g/L na 10 g/L.
Na temelju potpunog faktorskog dizajna i dizajna površine odgovora u DoE alatima, brzo smo prepoznali i optimizirali ključne parametre fermentacije. Pod optimiziranim procesom fermentacije visoke gustoće stanica, razina ekspresije porasla je na 10 g/L.
Naša iskustva
- Radili smo na raznim vrstama mikrobnih domaćina, npr. E. coli DH5α, TOP10, Trans10, BL21; Pichia pastoris (P. pastoris) SMD1168H, X-33, GS115, PichiaPink soj 1/2/3/4; Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) i Hansenula polimorfna (H. polymorpha).
- Imamo iskustva s E. coli periplazmatična sekrecija, ekspresija topljivih i inkluzijskih tjelešaca, kao i intracelularna ili izvanstanična ekspresija kvasca. Prinos inkluzijskog tijela je do 10 g/L, dok se prinos topivih proteina kreće od 0.5 do 15 g/L.
- Sudjelovali smo u razvoju i proizvodnji raznih velikih molekula, uključujući rekombinantna podjedinična cjepiva, čestice slične virusu (VLP), hormone (inzulin, GLP-1, hormon rasta), citokine (Interleukin-2/IL-2, IL -15, IL-21), faktori rasta (EGF, FGF, NGF), nanotijela/protutijela s jednom domenom (sdAbs), enzimi itd.
- Oprema
7L*16 Sustav za fermentaciju
Cedex Bio Analyzer, Bioprocess analizator
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
