L'occupation du site de N-glycosylation est une caractéristique physiologique des glycoprotéines et produit principalement des N-glycanes. Le service d'analyse de l'occupation du site de N-glycosylation de Yaohai Bio-Pharma est réalisé par digestion, libération, enrichment et analyse à l'aide de la Chromatographie en Phase Liquide-Ionisation par Pulvérisation Électrospray Spectrométrie de Masse-Spectrométrie de Masse (LC-ESI-MS/MS).
Nous avons été impliqués dans la caractérisation structurale des protéines de diverses grandes molécules, y compris les vaccins à sous-unités recombinants, les nanocorps/VHHs/anticorps à domaine unique (sdAbs), les fragments d'anticorps, les hormones/peptides, les cytokines, les facteurs de croissance (FC), les enzymes, les collagènes, etc.
Exigences Réglementaires pour l'Occupation du Site de N-glycosylation
Selon la directive ICH Q6B, « pour les glycoprotéines, la teneur en glucides (sucres neutres, sucres aminés et acides sialiques) est déterminée. De plus, la structure des chaînes de glucides, le motif des oligosaccharides (profil antennaire) et le ou les site(s) de glycosylation de la chaîne polypeptidique sont analysés dans la mesure du possible. »
Méthode analytique
| Analyse |
Méthodes |
| Occupation du Site de N-glycosylation |
LC-MS après digestion par déglycosidase et protéase |
Procédures
1. Digestion des protéines pour générer de petits fragments de peptides.
2. Libération des N-glycanes à l'aide d'endoglucosidase H ou PNGase F. L'endoglucosidase H coupe le lien entre les deux résidus de GlcNAc dans le cœur des glycanes liés par liaison N, tandis que la PNGase F est une glycoamidase qui sectionne le lien entre le GlcNAc et l'Asn, libérant toute la chaîne sucre et convertissant l'Asn en Asp avec une augmentation de masse de 1 Da.
3. Enrichissement des N-glycopeptides par HILIC (Chromatographie en phase hydrophile)
4. Analyse de l'occupation des sites de glycosylation liés par liaison N par LC-ESI-MS/MS.
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