5'-končna zaklepanje je bistvena sprememba mRNA. mRNA z zaklepni strukture, posebej Cap1 strukture, omogočajo mRNA izogibati si vgrajene imunskih odzivov v živih organizmah, kar pomeni učinkovito prevajanje proteina.
Enzimatsko zaklepanje (dvokorak method) je tradicionalna metoda zaklepanja mRNA, podobna procesu zaklepanja v eukariotskih organizmih. Pod delovanjem vrste enzimov se 7-metilguanin (m7G) poveže na 5'-koncu mRNA prek trifosfatne vezi 5'-5' in podlega metilaciji, ki oblikuje zaklepno strukturo Cap 1 (m7GpppN).
Diagram oblike naravne zaklepne strukture
Tok enzimatske zaklepne reakcije je naslednji:
Linearni plazmidni DNA se uporablja kot predloga za transkripcijo in vitro (IVT) v prisotnosti T7 polimeraze, in mRNA z 5' end-cap strukturo se oblikuje po enokorakem očiščanju s pomočjo vakcinije capping enzyme in 2'-O-metiltransferaze.
Izbirne storitve |
Podrobnosti storitev |
Dobavni rok (dan) |
enzimatsko zakrivanje mRNA |
Enzimski capping reakcija |
1 |
Optimizacija capping reakcije - izbirno |
Načrtovanje in optimizacija sestavnih delov reakcije |
3~7 |
Komponenta capping reakcije je bila optimizirana, kar je znatno povečalo proizvodnjo mRNA transkripta.
Capped mRNA se transficira v 293T celice, in je mogoče zaznati izraz ciljnega proteina.
S strogo kontrolijo RNase v eksperimentalnem okolju in potrošniških materialih se učinkovito prepreči degradacija mRNA.
Platforma mRNA od Yaohai Bio-Pharma je razvila popoln proces zakrivanja.
Za eGFP mRNA, predproizvod mRNA pripravljen s enzymatskim zakrivanjem, se lahko 24 ure po transfekciji celic 293T opazi intenziven eGFP fluorescenčni signal (zeleno fluorescenca), ki ga zaznamemo s pomočjo Western Blot (WB), kar dokazuje, da se ciljni protein, izboljšana zelena fluorescenca (eGFP), učinkovito izraža v vitro.
Izraz enzymatsko zakrite eGFP mRNA v celici 293T