V zvezi z masovnim proizvodnjo mRNA je transkripcija v testu (IVT) učinkovitejša in zrelejša metoda. IVT reakcija uporablja linearno plazmidno DNS, ki vsebuje T7 promotor kot predložek, in je mRNA sintetizirana z nukleozidnimi trifosfatami (NTPs) kot substrati v prisotnosti T7 RNA polimeraze.
Spreminjanje nukleotidov je prelom v raziskovanju mRNA, kjer so nepremenične mRNA molekule prepoznavane s strani intracelularnih senzorjev RNA za aktiviranje predhodnega imunosa. Zaradi razlaganja imunogennosti mRNA v živu in učinkovitosti prevajanja se v procesu IVT običajno uporabljajo določeni vrste spremenjenih NTP-jev, med najpogostejšimi spremenjenimi nukleotidi pa so psiudouridin (Ψ), N1-metil-psiudouridin (N1Ψ) in 5-metilcitozin (5mC).
Proces transkripcije mRNA v laboratoriju
Diagram reakcije transkripcije v laboratoriju (IVT)
Podrobnosti storitev
Izbirne storitve |
Podrobnosti storitev |
Doba dostave (delovni dan) |
Transkripcija v testu (IVT) |
IVT, Transkripcija v laboratoriju |
1 |
| Spremenjeni nukleotidi (Ψ/N1Ψ/5mC itd.) |
| Odstranitev DNS predloge (DNase I) |
Optimizacija pogojev IVT - izbirno |
Načrtovanje in optimizacija komponent reakcije IVT |
2-5 |
Naše značilnosti
- Raznovrstne strategije modifikacije nukleotidov
Poboljšanje stabilnosti mRNA in izražanja proteina v vivo.
- Stroga izhodiščna razlika in optimizacija testa
priprava fragmentov mRNA do 10kb je mogoča.
S optimizacijo pogojev reakcije IVT je hitrost transkripcije do 1:200.
Strog nadzor RNase skozi poskusno okolje in potrošninske material glede učinkovito prepreči degradacijo mRNA.
Studija primerov
Trenutni sistem IVT reakcije je približno optimiziran za sintetične sisteme z dolžino okoli 100 nt, ne pa za mRNA poljubne dolžine. Še dlajši zaporedji mRNA so težji za transkripcijo in bolj podvrženi degradaciji.
Za pripravo prilagojenih mRNA zaporedij z dolžino okoli 10 kb je Yaohai Bio-Pharma uspešno pripravila visokokakovostne vzorce s transkripcijo v razmerju 1:135 in je dobila 135 μg počistnih mRNA izdelkov po tem, ko je bil 1 μg linearnega plazmida transkribiran v vitro prek strogega poskusnega načrtovanja, neprekinjene optimizacije pogojev reakcije in strogega nadzora RNase.
identifikacija mRNA (elektroforeza v agarosovem gelu)
SL
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
