Le proteine ricombinanti spesso vedono l'ossidazione delle catene laterali degli amminoacidi esposti, come il triptofano (Trp) e la metionina (Met), modificando le proprietà fisico-chimiche delle proteine. Questi cambiamenti possono a loro volta contribuire ad alterare le funzioni biologiche delle proteine interessate, come perdita di legame, riduzione dell'attività enzimatica, clearance inaspettatamente rapida. Le proteine sono bersagli importanti per le reazioni ossidative perché reagiscono rapidamente con gli ossidanti e sono abbondanti nelle cellule, nei tessuti extracellulari e nei fluidi corporei.
Pertanto, il monitoraggio dell’ossidazione delle proteine è fondamentale per il successo dello sviluppo biofarmaceutico.
Yaohai Bio-Pharma offre un servizio di analisi dell'ossidazione degli amminoacidi, che consente di determinare l'ossidazione degli amminoacidi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).
Siamo stati coinvolti nella caratterizzazione strutturale proteica di varie molecole di grandi dimensioni, inclusi vaccini a subunità ricombinanti, nanocorpi/VHH/anticorpi a dominio singolo (sdAbs), frammenti di anticorpi, ormoni/peptidi, citochine, fattori di crescita (GF), enzimi, collageni, eccetera.
Requisiti normativi per l'ossidazione degli amminoacidi
Secondo le linee guida ICH Q6B, le forme ossidate possono essere rilevate e caratterizzate mediante cromatografia, elettroforesi e/o altri metodi analitici pertinenti (ad esempio, cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), elettroforesi capillare, spettroscopia di massa, dicroismo circolare).
Metodi analitici
| Analisi |
Metodi |
| Ossidazione degli amminoacidi |
LC-MS, cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa (RP-HPLC) o cromatografia ad interazione idrofobica cromatografia liquida ad alte prestazioni (HIC-HPLC) e spettrometria di massa |
Procedure analitiche
1. Preparazione del campione
2. LC-MS
3. Analisi dei dati
I residui di triptofano (Trp) sono particolarmente soggetti all'ossidazione a causa dell'elevata reattività dell'indolo aromatico con le specie reattive dell'ossigeno. L'ossidazione del Trp richiede una certa esposizione dei residui di Trp che normalmente sono sepolti nella struttura tridimensionale della proteina.
Tuttavia, quando i residui di Trp vengono ossidati, possono trasformarsi in una varietà di prodotti con proprietà molto diverse dal Trp originale. La via più comune per l'ossidazione del Trp include la formazione di N-formilchinurenina (differenza di massa: +32).
Un altro amminoacido comunemente ossidato è la metionina. L'atomo di zolfo nel residuo Met può accettare uno o due atomi di ossigeno portando rispettivamente alla formazione di solfossido (differenza di massa: +16) o solfone (differenza di massa: +32). Questa modifica è relativamente comune a causa dell'esposizione superficiale tipicamente elevata di Met.
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