RNAs lingkaran (circRNAs) pertama kali ditemukan sebagai RNAs non-kode pada tahun 1979; baru pada tahun 2015 ditemukan circRNAs yang ditranskripsikan pada Drosophila, yang mengarah pada penelitian tentang circRNAs in vitro untuk tujuan terapeutik dan pencegahan.
circRNAs bersifat self-expanding sehingga tidak memiliki struktur konvensional seperti kap 5' atau ekor polyA 3'. Struktur ini membuat mereka lebih stabil dan tahan terhadap eksonukleasa seperti RNase R.
Unsur Struktur RNA Lingkaran (circRNA)
DNA template untuk sintesis circRNA biasanya mencakup situs masuk ribosom internal (IRES), kerangka baca terbuka (ORF), dan lainnya yang kritis untuk sirkulasi in vitro. Sebagai contoh, kami merancang plasmid sebagai template transkrip in vitro (IVT), yang terdiri dari lengan homologi, intron 3', ekson 3', IRES, ORF, ekson 5', dan intron 5', untuk menyiapkan circRNA melalui metode self-splicing.
Situs Masuk Ribosom Internal (IRES) memainkan peran penting dalam terjemahan cirRNAs. IRES virus Encephalomyocarditis (EMCV), IRES coxsackievirus B3 (CVB3), IRES rhinovirus manusia B3 (HRV-B3), dan IRES lainnya telah sering digunakan untuk terjemahan sintesis in vitro cirRNAs.
Siklizasi in vivo dari prekursor linier circRNA menyediakan langkah penting dalam sintesis circRNA, biasanya melalui jalur kimia, enzimatik, dan replikasi mandiri yang dimediasi ribosom. Dikenal sebagai tonggak sejarah di bidang ini, pendekatan kimia untuk produksi circRNA, yang berasal dari tahun 1988, tidak lagi digunakan saat ini karena biayanya yang tinggi, hasil yang rendah, jumlah produk sampingan yang banyak, dan kenyataannya hanya cocok untuk mensiklisis RNAs hingga panjang 70 nukleotida.
Metode enzimatik untuk mengikat siklus RNA didasarkan pada enzim bakteriofag T4 atau ribozim seperti ligase DNA T4 (T4 Dnl 1), ligase RNA T4 1 (T4 Rnl 1), dan ligase RNA T4 2 (T4 Rnl 2). Untuk membentuk RNA lingkaran dengan enzim bakteriofag T4, nukleosida monofosfat harus berada di ujung 5' dan dikonjugasi dengan grup OH di ujung 3' RNA. Karena nukleosida trifosfat ditambahkan selama reaksi, IVT RNA mengandung guanosin trifosfat (GTP) di ujung 5'.
Ribozim adalah urutan RNA yang mempromosikan penyambungan diri dengan mengubah molekul RNA linier menjadi circRNA tanpa kebutuhan enzim tambahan. Proses penyusunan diri melibatkan dua reaksi transesterifikasi berturut-turut di situs tertentu untuk memastikan bahwa produk cirRNA yang diinginkan terbentuk. Metode penyambungan diri intron golongan I, juga dikenal sebagai PIE (enkapsulasi intron dan ekson), yang memungkinkan produksi cirRNAs lebih dari 5 kb, telah banyak dipelajari dan terbukti bermanfaat.
Aplikasi RNA Lingkaran (circRNA)
Vaksin circRNA
Seperti mRNA linear, circRNA dapat diubah menjadi protein tertentu di sel target dan menginduksi kekebalan humoral dan seluler yang kuat. Baru-baru ini, ada beberapa tim penelitian yang berhasil mengembangkan vaksin circRNA untuk mencegah COVID-19. Hasil mereka tidak hanya memiliki keunggulan vaksin mRNA linear, tetapi juga menunjukkan stabilitas yang lebih baik dan durasi ekspresi protein yang lebih lama dibandingkan dengan mRNA linear. Oleh karena itu, vaksin circRNA dapat menginduksi respons imun yang memadai bahkan pada dosis rendah.
Selain itu, beberapa peneliti berpikir bahwa vaksin circRNA, sebagai generasi berikutnya dari mRNA, mungkin akan menjadi alat efektif di masa depan untuk melawan penyakit virus/bakteri umum dan penyakit infeksius baru yang utama, serta untuk pengobatan kanker dan penyakit lainnya.
CircRNA dalam Terapi CAR/TCR-T
Sebagai pelopor di bidang RNA lingkaran, ORNA telah mengembangkan terapi reseptor antigen kimeris (CAR) in situ untuk terapi in situ yang memanfaatkan ORN-101, sebuah RNA lingkaran yang dibungkus LNP, untuk memodulasi sel imun pada pasien. ORN-101 menunjukkan ekspresi CAR yang tinggi yang didorong oleh elemen IRES yang dioptimalkan. Pada model hewan, ORN-101 terbukti menekan dan menghancurkan tumor, menunjukkan bahwa terapi antikanker berbasis ORN-101 dapat mengganggu terapi konvensional CAR-T.
Selain itu, Zhang et al. mengevaluasi viabilitas dan efikasi terapeutik dari circRNA dalam terapi reseptor T-sel (TCR)-T spesifik antigen. Mereka merancang sebuah circRNA yang mengkodekan pp65-TCR-T yang menargetkan epitop pp65 dari cytomegalovirus (CMV). Selain itu, pp65-TCR diperlihatkan diekspresikan pada sel T primer selama lebih dari 7 hari. Selain itu, sel circRNA-pp65-TCR-T secara khusus dan konsisten membunuh sel tumor yang mengekspresikan pp65 dan HLA serta secara signifikan memperpanjang waktu hidup tikus.
Juga ditunjukkan bahwa sel yang ditransfeksi dengan pp65 circRNA menunjukkan respons imun yang lebih baik dibandingkan dengan linear mRNA.
Yaohai’s Bio-Pharma One-Stop CRDMO Solution untuk Long-Coding RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
