I forhold til den to-trins enzymatiske capping kan den en-trins co-transkriptionelle capping-metode betydeligt reducere procesflowet. Metoden er resultatorienteret og involverer tilføjelse af cap-analoger til den in vitro transkription (IVT)-reaktion. Cap-analoger kan introduceres ved begyndelsen af transkriptionen, og mRNA med cap-struktur kan opnås ved afslutningen af transkriptionen. De nuværende tredjegenerations cap-analoger kan undgå omvendt capping og direkte tilføje Cap 1-struktur til transkriptionsproduktet.
Af hensyn til mRNA's immunogenitet in vivo og oversættelseseffektivitet anvender IVT-processen ofte visse typer af modificerede NTP'er, og de almindelige modificerede nukleotider er pseudouridin (Ψ), N1-methyl-pseudouridin (N1Ψ) og 5-methylcytosin (5mC).
Figur: Skitse af mRNA Co-transkription og Capping-Reaktion
Service |
Servicedetaljer |
Leveringsperiode (arbejdsdag) |
Co-transkriptionel capping |
In vitro transskriptionsrespons (Clean Cap analog) | 1-2 |
Nukleotidmodifikationer (Ψ/N1Ψ/5mC) | ||
Fjernelse af DNA-skabelon (DNase I) | ||
Optimering af IVT-betingelser - valgfrit |
Design og optimering af reaktionskomponenter | 3-7 |
Flere valgfrie nukleotidmodifikationsstrategier kan forbedre proteinekspressionen.
Opnå et højt transkriptionsforhold og en høj capping-effektivitet.
Opnå en capping rate på mere end 95%.
Forhindre mRNA nedbrydning effektivt ved strikt kontrol af RNase i det eksperimentelle miljø og forbrugsmaterialer.
Yaohai Bio-Pharma har oprettet et moden co-transcriptional capping procesplatform, hvor der bruges rene cap analoger til at tilføje Cap1-struktur direkte, samtidig med at man undgår omvendt capping. Efter standardiseret prøveforbehandling og kapillær-elektroforese (CE) detektering, kan capping raten for den forstærkede grøn fluorescerende protein (eGFP) mRNA nå mere end 95%.
capping effektivitet for eGFP mRNA på mere end 95%
Den co-transcriptionalt cappede eGFP mRNA og mCherry mRNA transfectes i 293T celler henholdsvis, og der observeres en stærk fluorescerende signal efter 48 timer, hvilket indikerer, at mRNA'et effektivt udtrykkes i 293T cellerne.
Udtryk for eGFP mRNA og mCherry mRNA i 293T celle