kapiranje na 5'-kratku je ključna modifikacija mRNA. mRNA s kap strukturama, posebice Cap1 strukturama, omogućuju da mRNA izbjegnu prirodne imunološke odgovore in vivo, što rezultira učinkovitim prevođenjem proteina.
Enzimatsko kapiranje (dvokorak metoda) je konvencionalna metoda kapiranja mRNA, slična procesu kapiranja u eukariotskim organizmima. Pod djelovanjem niza enzima, 7-metilguanin (m7G) povezuje se s 5'-kratkim krajevima mRNA kroz 5'-5' trijfosfatnu vezu i podvrgava se metilacijskoj modifikaciji kako bi se formirao kap struktura Cap 1 (m7GpppN).
Dijagram oblikovanja prirodnih kap struktura
Toka enzimatskog kapiranja reakcije je sljedeći:
Linearizirana plazmidna DNA koristi se kao šablon za transkripciju in vitro (IVT) u prisutnosti T7 polimeraze, a mRNA s 5'-kap strukturom formira se nakon jednokratne čišćenja pomoću vakcinijanske kapiranje enzima i 2'-O-metiltranzferaze.
Opcionalna usluga |
Detalji usluge |
Rok isporuke (Dan) |
enzimatsko zaključivanje mRNA |
Enzimatska zaključna reakcija |
1 |
Optimizacija zaključne reakcije - opcionalno |
Dizajn i optimizacija komponenti reakcije |
3~7 |
Komponenta zaključne reakcije je optimizirana, a proizvodnja mRNA transkripta je znatno povećana.
Zaključeni mRNA se transficira u 293T stanice, a izražavanje ciljnog proteina može biti otkriveno.
Putem stroge kontrole RNase u eksperimentalnom okruženju i potrošnji, degradacija mRNA je učinkovito sprečena.
MRNA platforma Yaohai Bio-Pharma je izgradila savršen proces zaključne reakcije.
Za eGFP mRNA, pre-proizvod mRNA pripremljen enzimatskim zakupljanjem, može se poslije transfekcije 293T stanica za 24 sata promatrati jači fluorescentski signal eGFP-a (zeleno fluorescenca), što se otkriva pomoću Western Blot (WB), čime se pokazuje da se ciljni protein pojačana zelena fluorescentska proteina (eGFP) može učinkovito izraziti in vitro.
Izraz Enzimatski Zakupljene eGFP mRNA u 293T Stanicama