Priprema CircRNA zahtijeva linearnu RNA kao prekursorski materijal (RNA prekursor) za ciklizaciju, pri čemu se RNA prekursor obično priprema korištenjem linearizirane plazmidne DNA kao transkripcijske šablone i transkribira in vitro uz pomoć T7 RNA polimeraze.
Plazmidna DNA visoke kvalitete neophodna je za in vitro transkripciju (IVT). Na temelju zrele platforme usluge pripreme plazmida, Yaohai Bio-Pharma može pružiti usluge pripreme visoke čistoće i standardne linearizirane plazmidne DNA (pDNA) kako bi se osigurao integritet IVT proizvoda.
Proces | Dodatna usluga | Pojedinosti usluge | Razdoblje isporuke (radni dan) |
Priprema kružnog plazmida | Sinteza gena | Sinteza gena (treća strana) | 7-10 |
Pojačanje plazmida | Pojačanje plazmida | 2 | |
Ekstrakcija plazmida | |||
Linearizirana priprema plazmida | Linearizacija i pročišćavanje plazmida | Linearizacija plazmida | 1 |
Linearizacija pročišćavanja DNA | |||
Kontrola kvalitete plazmidne DNA | Čistoća koncentracije | Ultraljubičasta (UV) spektrofotometrija | 1-2 |
Konformacija plazmida | Elektroforeza u agaroznom gelu (AGE) | ||
Kapilarna elektroforeza (CE)-po izboru | |||
Identifikacija plazmida | Identifikacija restrikcijskih enzima/ AGE |
Fleksibilan odabir metoda linearizacije
Optimizacija ekstrakcije DNA i metoda pročišćavanja za postizanje visokih stopa oporavka.
Strogi standardi kontrole procesa, sa stopom superhelikalne konformacije uzoraka plazmida za istraživanje od preko 80%.
Visoki standard i visoko učinkovite usluge pripreme plazmida i kontrole kvalitete za ispunjavanje eksperimentalnih potreba.
Uzimajući proizvod Yaohai Bio-Pharma mCherry circRNA kao primjer, superzavojni omjer uzoraka plazmida transkripcijskih predložaka (razina istraživanja) je više od 70%, sa stopom linearizacije od blizu 100%.
mCherry circRNA je pripremljena s lineariziranim plazmidom kao predloškom i transficirana u 293T stanice. Visoka razina ekspresije fluorescencije (crvena fluorescencija) detektira se nakon 24 sata od transfekcije, koja će se pojačati nakon 48 sati, a još uvijek se može detektirati 7. dan i 14. dan nakon transfekcije.
Protein mCherry se stabilno i učinkovito eksprimira, a čistoća transkripcijskog predloška može zadovoljiti zahtjeve za circRNA lijekom (DP) visoke kvalitete.
In vitro validacija ekspresije mCherry circRNA