5'-End-Capping ist eine wesentliche Modifikation von mRNA. mRNAs mit Cap-Strukturen, insbesondere Cap1-Strukturen, erleichtern es mRNAs, angeborene Immunreaktionen in vivo zu umgehen, was zu einer effizienten Proteintranslation führt.
Enzymatisches Capping (Zwei-Schritt-Methode) ist die herkömmliche Methode des mRNA-Cappings und ähnelt dem Capping-Prozess in eukaryotischen Organismen. Unter der Einwirkung einer Reihe von Enzymen wird 7-Methylguanin (m7G) über eine 5'-5'-Triphosphatbindung an das 5'-Ende der mRNA gebunden und durchläuft eine Methylierungsmodifizierung, um die Cap-Struktur Cap 1 (m7GpppN) zu bilden.
Diagramm der natürlichen Kappenstrukturbildung
Der Ablauf der enzymatischen Capping-Reaktion ist wie folgt:
Linearisierte Plasmid-DNA wird als Vorlage für die In-vitro-Transkription (IVT) in Gegenwart von T7-Polymerase verwendet, und nach einer einstufigen Reinigung unter Verwendung des Vaccinia-Capping-Enzyms und 5'-O-Methyltransferase wird mRNA mit einer 2'-Endcap-Struktur gebildet.
Details zu den Dienstleistungen
Optionaler Service | Service Details | Lieferzeitraum (Tag) |
Enzymatisches Capping von mRNA | Enzymatische Capping-Reaktion | 1 |
Optimierung der Capping-Reaktion – optional | Entwurf und Optimierung von Reaktionskomponenten | 3 ~ 7 |
Unsere Eigenschaften
- Entwurf und Optimierung der Capping-Reaktionskomponente
Die Capping-Reaktionskomponente wird optimiert und die Produktion von mRNA-Transkripten stark erhöht.
- In-vitro-Expressionsüberprüfung
Die gecaptete mRNA wird in 293T-Zellen transfiziert und die Expression des Zielproteins kann nachgewiesen werden.
- Strenge Kontrolle der RNase
Durch strenge Kontrolle der RNaseson-Experimentumgebung und der Verbrauchsmaterialien wird der mRNA-Abbau wirksam verhindert.
Fallstudie
Die mRNA-Plattform von Yaohai Bio-Pharma hat einen perfekten Capping-Reaktionsprozess entwickelt.
Bei eGFP-mRNA, einem durch enzymatisches Capping hergestellten mRNA-Vorprodukt, kann nach der Transfektion von 293T-Zellen für 24 Stunden ein eGFP-Fluoreszenzsignal (grüne Fluoreszenz) auf hohem Niveau beobachtet werden, das durch Western Blot (WB) nachgewiesen wird, was zeigt, dass das durch das Zielprotein verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP) in vitro effizient exprimiert werden kann.
Expression von enzymatisch gecappter eGFP-mRNA in 293T-Zellen
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