Bei der Batch-Herstellung von RNA-Vorläufern ist die In-vitro-Transkription (IVT) eine häufig verwendete Methode. Die IVT-Reaktion verwendet linearisierte Plasmid-DNA, die den T7-Promotor als Vorlage enthält, und synthetisiert in Gegenwart von T7-RNA-Polymerase einen RNA-Vorläufer mit Nukleosidtriphosphaten (NTPs) als Substrat.
Zu den In-vitro-Zyklisierungsmethoden gehören die chemische Ligation, die enzymatische Ligation und die permutierte Intron-Exon-Methode (PIE). Die chemische Ligation und die enzymatische Ligation eignen sich für die Zyklisierung kürzerer RNAs. Wenn das Fragment größer als 100 nt ist, nimmt die Zyklisierungsrate stark ab. Im Gegensatz dazu kann mit der auf dem PIE-System basierenden Nukleasemethode eine Zyklisierung von 8-kb-Sequenzen erreicht werden.
Unter der Katalyse von Guanosintriphosphat (GTP) erfährt die PIE-Struktur eine Zyklisierung von Extra-Intron-Sequenzen. In Kombination mit einer sinnvollen Strategie zur Erhöhung der Zyklisierungsrate kann Yaohai Bio-Pharma eine Zyklisierung von bis zu 4 kb langen Sequenzen mit einer Zyklisierungseffizienz von über 80 % erreichen.
Die In-vitro-Zyklisierungsreaktion von RNA läuft wie folgt ab:
Der RNA-Vorläufer wird durch In-vitro-Transkription synthetisiert und die PIE-Komponente führt unter der Katalyse von GTP das Selbstspleißen durch, um circRNA zu bilden.
Details zu den Dienstleistungen
| Prozess | Service Details | Lieferzeit (Werktage) |
| In-vitro-Transkription und Zirkulation | Bestätigung des Reaktionssystems | 1-2 |
| In-vitro-Transkriptions- und Cyclisierungsreaktionen |
| RNase R-Verdauung |
| Reaktionsoptimierung | Reaktionszusammensetzung, Zeitoptimierung | 2-5 |
Unsere Eigenschaften
- Rigoroses Testdesign und -optimierung
Es kann eine RNA-Zyklisierung von bis zu 4 kb erreicht werden.
- Hohe Zyklisierungseffizienz
Durch eine rationale Sequenzoptimierungsstrategie kann eine Zyklisierungsrate von über 80 % erreicht werden.
- Strenge Kontrolle der RNase
Durch strenge Kontrolle der RNasen in der Versuchsumgebung und den Verbrauchsmaterialien wird der RNA-Abbau wirksam verhindert.
Fallstudie
In vitro Zyklisierung und Anreicherung von circRNA
Basierend auf dem PIE-System hat Yaohai Bio-Pharma die Sequenz von circRNA optimiert und durch Agarose-Gelelektrophorese (AGE) eine Zyklisierungsrate von über 80 % erreicht. Unter Verwendung von RNase R zur Anreicherung von circRNA zeigen die Ergebnisse der E-Gelelektrophorese, dass der lineare RNA-Vorläufer verdaut wird und nach weiterer Reinigung der Großteil der geknickten circRNA entfernt werden kann. Die Reinigungslösung wurde von Yaohai Bio-Pharma selbst entwickelt.
In-vitro-Zirkulation und Anreicherung von circRNA
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