Bezüglich der Massenproduktion von mRNA ist die In-vitro-Transkription (IVT) eine effizientere und reifere Methode. Die IVT-Reaktion verwendet linearisierte Plasmid-DNA, die den T7-Promotor enthält, als Vorlage, und mRNA wird mit Nukleosidtriphosphaten (NTPs) als Substrate in Gegenwart von T7-RNA-Polymerase synthetisiert.
Die Nukleotidmodifikation ist ein Durchbruch in der Erforschung von mRNA, da unmodifizierte mRNA-Moleküle von intrazellulären RNA-Sensoren erkannt werden, um die angeborene Immunabwehr zu aktivieren. Aus Gründen der in-vivo-Immunogenität von mRNA und der Übersetzungs-effizienz verwendet der IVT-Prozess normalerweise bestimmte modifizierte NTPs, und gebräuchliche modifizierte Nukleotide sind Pseudouridin (Ψ), N1-Methyl-Pseudouridin (N1Ψ) und 5-Methylcytosin (5mC).
In-Vitro-Transkription von mRNA
Diagramm der In-Vitro-Transkriptionsreaktion
Dienstleistungen Details
Optionale Dienstleistungen |
Service Details |
Lieferzeit (Arbeitstag) |
In vitro Transkription (IVT) |
IVT, In-vitro-Transkription |
1 |
| Nukleotidmodifikationen (Ψ/N1Ψ/5mC, etc.) |
| DNA-Vorlagenentfernung (DNase I) |
Optimierung der IVT-Bedingungen - optional |
Design und Optimierung der IVT-Reaktionskomponenten |
2-5 |
Unsere Funktionen
- Verschiedenartige Nukleotidmodifikationsstrategien
Verbesserung der Stabilität von mRNA und der Proteinausdrückung in vivo.
- Strenge Testgestaltung und -optimierung
die Präparation von mRNA-Fragmenten bis zu 10kb ist möglich.
Durch Optimierung der IVT-Reaktionsbedingungen beträgt die Transkriptionsrate bis zu 1:200.
- Strenge Kontrolle von RNasen
Strenge Kontrolle von RNase durch den Versuchsumgebungs- und Verbrauchsmaterialienschutz kann eine effektive Verhinderung der mRNA-Degradation gewährleisten.
Fallstudie
Das aktuelle IVT-Reaktionssystem ist grob für synthetische Systeme mit einer Länge von etwa 100 Nukleotiden optimiert, nicht für mRNA beliebiger Länge. Je länger die mRNA-Sequenz, desto schwieriger ist es, sie zu transkribieren, und desto anfälliger ist sie für Degradation.
Um individuell angepasste mRNA-Sequenzen mit einer Länge von etwa 10 kb vorzubereiten, hat Yaohai Bio-Pharma durch sorgfältige experimentelle Planung, kontinuierliche Optimierung der Reaktionsbedingungen und strenge Kontrolle von RNase erfolgreich hochwertige Proben mit einem hohen Transkriptionsverhältnis von 1:135 vorbereitet und 135 μg an zunächst gereinigten mRNA-Produkten erhalten, nachdem 1 μg des linearisierten Plasmids in vitro transkribiert wurde.
mRNA-Identifizierung (Agarose-Gel-Elektrophorese)
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