Bei der Stufengenerierung von RNA-Vorstufen wird eine gebräuchliche Methode als in vitro Transkription (IVT) bezeichnet. Die IVT-Reaktion verwendet linearisiertes Plasmid-DNA, das den T7-Promotor enthält, als Vorlage und synthetisiert einen RNA-Vorstoff mit Nukleosidtriphosphaten (NTPs) als Substrat in Gegenwart von T7-RNA-Polymerase.
In vitro Zyklisierungsverfahren umfassen chemische Ligierung, enzymatische Ligierung und die permuted intron-exon (PIE)-Methode. Chemische Ligierung und enzymatische Ligierung eignen sich für die Zyklisierung kürzerer RNAs. Wenn das Fragment größer als 100 nt ist, nimmt die Zyklisierungsrate stark ab. Im Gegensatz dazu kann die auf dem PIE-System basierende Nuklease-Methode die Zyklisierung von 8-kb-Sequenzen erreichen.
Unter der Katalyse von Guanosintriphosphat (GTP) untergeht die PIE-Struktur eine Zyklisierung von extra-intronischen Sequenzen. In Kombination mit einer sinnvollen Strategie zur Erhöhung der Zyklisierungsrate kann Yaohai Bio-Pharma eine Zyklisierung von bis zu 4 kb langen Sequenzen erreichen, mit einer Zyklisierungseffizienz von über 80 %.
Die in vitro Zyklisierungsreaktion von RNA verläuft wie folgt:
Das RNA-Vorläufermolekül wird durch in vitro Transkription synthetisiert, und das PIE-Element vollendet die Selbst-Splicing unter der Katalyse von GTP, um circRNA zu bilden.
Dienstleistungen Details
| Prozess |
Service Details |
Lieferzeit (Arbeitstag) |
| In-vitro-Transkription und Zirkulation |
Reaktionssystembestätigung |
1-2 |
| In-vitro-Transkriptions- und Zyklisierungsreaktionen |
| RNase R Verdauung |
| Reaktionsoptimierung |
Reaktionszusammensetzung, Zeitoptimierung |
2-5 |
Unsere Funktionen
- Strenge Testgestaltung und -optimierung
Eine RNA-Zyklisierung von bis zu 4 kb ist erreichbar.
- Hohe Zyklisierungseffizienz
Durch eine rationale Sequenzoptimierungsstrategie kann eine Zyklisierungsrate von über 80 % erreicht werden.
- Strenge Kontrolle von RNasen
Durch strenge Kontrolle von RNasen in der Experimentumgebung und den Verbrauchsmaterialien wird die Degradation von RNA wirksam verhindert.
Fallstudie
In-vitro-Zyklisierung und -Anreicherung von circRNA
Basierend auf dem PIE-System hat Yaohai Bio-Pharma die Sequenz von circRNA optimiert, wobei eine Zyklisierungsrate von über 80 % durch Agarose-Gel-Elektrophorese (AGE) erreicht wurde. Durch die Verwendung von RNase R zur Anreicherung von circRNA zeigen E-gel-Elektrophoresergebnisse, dass das lineare RNA-Vorgängerstoff abgebaut wird und nach weiterer Reinigung die meisten gespaltenen circRNA entfernt werden können. Die Reinigungslösung wurde von Yaohai Bio-Pharma selbst entwickelt.
In-vitro-Zirkulation und -Anreicherung von circRNA
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