Dane mapowania peptydów oparte na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) dostarczą dużej ilości informacji na temat struktury pierwotnej i wyższego rzędu białek natywnych i rekombinowanych, w tym pokrycia sekwencji aminokwasów, modyfikacji potranslacyjnych (PTM, np. glikozylacja , utlenianie, deamidowanie), wiązania dwusiarczkowe itp.
Yaohai Bio-Pharma oferuje usługi analizy mapowania peptydów dla docelowego białka za pomocą LC-MS, aby przyspieszyć badania struktury białka.
Braliśmy udział w charakteryzacji strukturalnej białek różnych dużych cząsteczek, w tym rekombinowanych szczepionek podjednostkowych, nanociał/VHH/przeciwciał jednodomenowych (sdAbs), fragmentów przeciwciał, hormonów/peptydów, cytokin, czynników wzrostu (GF), enzymów, kolagenów, itp.
Wymagania regulacyjne dotyczące mapowania peptydów
Wytyczne ICHQ6B zalecają: „Selektywną fragmentację produktu na odrębne peptydy przeprowadza się przy użyciu odpowiednich enzymów lub substancji chemicznych, a powstałe fragmenty peptydowe analizuje się metodą HPLC lub inną odpowiednią procedurą analityczną. Fragmenty peptydowe należy w miarę możliwości identyfikować przy użyciu technik takich jak analiza składu aminokwasów, sekwencjonowanie N-końca lub spektrometria mas (MS). Mapowanie peptydów substancji czynnej lub produktu leczniczego (DP) przy użyciu odpowiednio zwalidowanej metody jest metodą często stosowaną w celu potwierdzenia pożądanej struktury produktu do zwolnienia serii.”
Metody analityczne
| Analiza |
Metody |
| Mapowanie peptydów |
Trawienie proteazami i chromatografia cieczowa-spektrometria mas (LC-MS) |
Procedura analityczna
1. Redukcja i alkilowanie
Celem jest redukcja mostków dwusiarczkowych i zablokowanie wytworzonego wolnego tiolu. Redukcja mostków dwusiarczkowych pomaga otworzyć strukturę białka, co sprawia, że trawienie proteolityczne jest bardziej efektywne. Ten etap spowoduje również przerwanie mostków między łańcuchami w przypadku białek wielołańcuchowych, które mają mostki dwusiarczkowe łączące łańcuchy (np. przeciwciała monoklonalne, mAb).
2. Trawienie białka za pomocą enzymów
Celem jest rozbicie białka na peptydy. Enzymy wybraliśmy w oparciu o teoretyczną sekwencję białka i wiedzę na temat teoretycznego trawienia białka przez enzymy. Wybierając w ten sposób enzymy, powinniśmy uzyskać najlepszą analizę mapowania peptydów.
3. Analiza strawionych peptydów Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconą fazą on-line z ultrafioletem (UV) i detekcją spektrometrią mas przez elektrorozpylanie (LC/ES-MS).
Separacja peptydów na podstawie polarności przy użyciu LC (LC z odwróconą fazą)
Gdy peptyd eluuje się z kolumny LC, spektrometr mas wygeneruje informację o masie wraz z informacją o jonach fragmentacyjnych, co umożliwi nam określenie informacji o sekwencji. Informacje o sekwencji wykorzystujemy do potwierdzenia tożsamości peptydu i dostarczenia podstawowych informacji.
Możemy również wygenerować informacje o fragmentacji z peptydów wchodzących do źródła spektrometru mas z kolumny LC. W zależności od wymagań badania jest to albo selektywna LC-MS/MS, albo nieselektywna, co można uznać za formę tandemowego MS.
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NIE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
