W białkach rekombinowanych często dochodzi do utleniania odsłoniętych łańcuchów bocznych aminokwasów, takich jak tryptofan (Trp) i metionina (Met), zmieniając właściwości fizykochemiczne białek. Zmiany te mogą z kolei przyczynić się do zmiany funkcji biologicznych dotkniętych białek, takich jak utrata wiązania, zmniejszenie aktywności enzymatycznej, nieoczekiwanie szybki klirens. Białka są ważnymi celami reakcji oksydacyjnych, ponieważ szybko reagują z utleniaczami i występują w dużych ilościach w komórkach, tkankach zewnątrzkomórkowych i płynach ustrojowych.
Dlatego monitorowanie utleniania białek ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego rozwoju biofarmaceutyków.
Yaohai Bio-Pharma oferuje usługę analizy utleniania aminokwasów, która pozwala określić stopień utlenienia aminokwasów metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS).
Braliśmy udział w charakteryzacji strukturalnej białek różnych dużych cząsteczek, w tym rekombinowanych szczepionek podjednostkowych, nanociał/VHH/przeciwciał jednodomenowych (sdAbs), fragmentów przeciwciał, hormonów/peptydów, cytokin, czynników wzrostu (GF), enzymów, kolagenów, itp.
Wymagania regulacyjne dotyczące utleniania aminokwasów
Zgodnie z wytycznymi ICH Q6B formy utlenione można wykrywać i charakteryzować metodami chromatograficznymi, elektroforetycznymi i/lub innymi odpowiednimi metodami analitycznymi (np. wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC), elektroforezą kapilarną, spektroskopią mas, dichroizmem kołowym).
Metody analityczne
| Analiza |
Metody |
| Utlenianie aminokwasów |
LC-MS, wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RP-HPLC) lub chromatografia oddziaływań hydrofobowych wysokosprawna chromatografia cieczowa (HIC-HPLC) i spektrometria mas |
Procedury analityczne
1. Przygotowanie próbki
2.LC-MS
3. Analiza danych
Reszty tryptofanu (Trp) są szczególnie podatne na utlenianie ze względu na wysoką reaktywność aromatycznego indolu z reaktywnymi formami tlenu. Utlenianie Trp wymaga pewnego odsłonięcia reszt Trp, które zwykle są ukryte w trójwymiarowej strukturze białka.
Jednakże, gdy reszty Trp ulegną utlenieniu, mogą przekształcić się w różnorodne produkty o bardzo odmiennych właściwościach od pierwotnego Trp. Najczęstsza droga utleniania Trp obejmuje tworzenie N-formylkinureniny (różnica mas: +32).
Innym powszechnie utlenionym aminokwasem jest metionina. Atom siarki w reszcie Met może przyjąć jeden lub dwa atomy tlenu, co prowadzi do powstania odpowiednio sulfotlenku (różnica mas: +16) lub sulfonu (różnica mas: +32). Modyfikacja ta jest stosunkowo powszechna ze względu na typowo dużą ekspozycję powierzchniową Met.
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NIE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
