A folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC-MS) alapú peptidtérképezési adatok nagy mennyiségű információt szolgáltatnak a natív és rekombináns fehérjék elsődleges és magasabb rendű szerkezetéről, beleértve az aminosav-szekvencia lefedettséget, a poszttranszlációs módosításokat (PTM-ek, pl. glikoziláció). , oxidáció, dezamidálás), diszulfid kötések stb.
A Yaohai Bio-Pharma peptid-térképezési szolgáltatásokat kínál a célfehérjéhez LC-MS segítségével, hogy felgyorsítsa a fehérjeszerkezetre vonatkozó kutatást.
Részt vettünk különböző nagy molekulák fehérjeszerkezeti jellemzésében, beleértve a rekombináns alegység vakcinákat, nanotesteket/VHH-kat/ egydoménes antitesteket (sdAb-okat), ellenanyag-fragmenseket, hormonokat/peptideket, citokineket, növekedési faktorokat (GF), enzimeket, stb.
A peptidtérképezés szabályozási követelményei
Az ICHQ6B irányelve a következőket ajánlja: „A termék szelektív, különálló peptidekre történő fragmentálását megfelelő enzimek vagy vegyszerek alkalmazásával kell elvégezni, és a kapott peptidfragmenseket HPLC-vel vagy más megfelelő analitikai eljárással elemzik. A peptidfragmenseket lehetőség szerint olyan technikák alkalmazásával kell azonosítani, mint az aminosav-összetétel elemzés, az N-terminális szekvenálás vagy a tömegspektrometria (MS). A hatóanyag vagy gyógyszertermék (DP) megfelelően validált módszerrel végzett peptid-térképezése gyakran használt módszer a tétel felszabadulásához szükséges termékszerkezet megerősítésére.”
Analitikai módszerek
| Elemzés |
Mód |
| Peptid térképezés |
Proteáz emésztés és folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC-MS) |
Analitikai eljárás
1. Redukció és alkilezés
A cél a diszulfidhidak csökkentése és a keletkező szabad tiol blokkolása. A diszulfid hidak redukciója elősegíti a fehérje szerkezetének megnyitását, ami hatékonyabbá teszi a proteolitikus emésztést. Ez a lépés a láncok közötti hidakat is megbontja olyan többláncú fehérjék esetében, amelyekben diszulfidhidak kötik össze a láncokat (pl. monoklonális antitestek, mAb-k).
2. A fehérje emésztése enzimek segítségével
A cél a fehérje peptidekre bontása. Az enzimek kiválasztását a fehérje elméleti sorrendje és a fehérje enzimekkel történő elméleti emésztésének ismerete alapján választottuk ki. Az enzimek ilyen módon történő megválasztásával a legjobb peptid-térképezési analízist kell eredményeznie.
3. Az emésztett peptidek elemzése On-line fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfia használata ultraibolya (UV) és elektropermet-tömegspektrometriás detektálással (LC/ES-MS).
Polaritáson alapuló peptid elválasztás LC-vel (fordított fázisú LC)
Ahogy a peptid eluálódik az LC oszlopról, a tömegspektrométer tömeginformációt generál a fragmens ion információval együtt, ami lehetővé teszi a szekvencia információ meghatározását. A szekvenciainformációkat a peptid azonosságának megerősítésére és az elsődleges információk biztosítására használjuk.
A fragmentációs információt is előállíthatjuk a peptidekből, amint azok belépnek a tömegspektrométer forrásába az LC oszlopból. A vizsgálat követelményeitől függően ez vagy szelektív LC-MS/MS vagy nem szelektív, ami a tandem MS egy formájának tekinthető.
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NEM
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
