Подготовка мРНК IVT

Транскрипция in vitro (IVT) является предпочтительным методом подготовки мРНК, способным давать микрограммы и миллиграммы мРНК в лабораторных масштабах. Для исследовательских целей поставщики реагентов разработали универсальные системы реакции IVT, подходящие для мРНК средней длины (1000-4000 нуклеотидов).

В этой статье мы рассмотрим транскрипцию мРНК in vitro (IVT), включая обычную систему реакции IVT, используемую в лабораторных масштабах, и систему реакции IVT, подходящую для сверхдлинных мРНК (>9000 нуклеотидов).

Наборы позволяют осуществлять котранскрипционное кэпирование с помощью CleanCap AG и снижать иммуногенность с помощью m1ψ. ДНКаза I удаляет остаточную ДНК. Низкий выход может быть вызван плохим смешиванием, окислением реагента или проблемами с шаблоном ДНК, которые можно смягчить центрифугированием, свежими реагентами, контролями и корректировкой количества шаблона/времени реакции.

Yaohai Bio-Pharma поставляет различные готовые продукты IVT RNA (жидкие/лиофилизированные порошки) и готовые продукты LNP, кодирующие белки, такие как флуоресцентные белки (eGFP, mCHERRY), люцифераза, рекомбиназа Cre и антиген OVA, для удовлетворения различных экспериментальных или проектных потребностей.

Система IVT для сверхдлинной мРНК

Обычный IVT может не работать для слишком длинной мРНК (>9000 нт). Необходимо глубокое понимание и рациональная настройка компонентов IVT.

Шаблон ДНК: Линеаризованные плазмиды или продукты ПЦР с соответствующими последовательностями промотора, растворенные в H2O без РНКазы. Для оптимальных условий IVT рекомендуется концентрация ДНК-матрицы выше 40 нМ.

ДТТ: Поддерживает активность фермента во время транскрипции. Для оптимальной активности фермента в реакционный буфер следует добавлять свежий DTT.

Ингибитор РНКазы: Подавляет активность РНКазы и сохраняет стабильность мРНК.

РНК-полимераза Т7: Катализирует транскрипцию ДНК в РНК, соответствующую последовательности промотора. Активность РНК-полимеразы Т7 зависит от pH и ионов магния.

Ионы магния (Mg2+): Кофактор для РНК-полимеразы. Слишком низкие концентрации снижают эффективность транскрипции, а слишком высокие концентрации приводят к деградации РНК. Свободный [Mg2+] следует регулировать на основе концентрации нуклеотидов. Каждый нуклеотид хелатирует один [Mg2+], поэтому концентрация [Mg2+] должна превышать общую концентрацию нуклеотидов.

Нуклеозидтрифосфаты (НТФ): В качестве субстратов NTP являются основными единицами РНК. Концентрации NTP выше 7 мМ оказывают положительное влияние на продукцию мРНК.

Спермидин: Стабилизирует комплексы ДНК-фермент и стимулирует реакции транскрипции; однако, чрезмерные концентрации оказывают ингибирующее действие. Рекомендуемая концентрация спермидина составляет от 1 до 3 мМ.

Неорганическая пирофосфатаза (PPase): Добавляется в реакции IVT для предотвращения накопления неорганических пирофосфатных ионов (PPi), избегая их хелатирования с Mg2+ и обеспечивая достаточное количество свободного Mg2+.

Используя передовые технологии и опыт работы с мРНК IVT, Yaohai Bio-Pharma предоставляет комплексную услугу по работе с РНК IVT, охватывающую проектирование последовательности, подготовку РНК IVT (с модификациями m1ψ), циклизацию РНК, очистку, сублимационную сушку, инкапсуляцию LNP и проверку качества.

Мы также активно ищем институциональных или индивидуальных глобальных партнеров. Мы предлагаем самую конкурентоспособную компенсацию в отрасли. Если у вас есть какие-либо вопросы, пожалуйста, свяжитесь с нами: [email protected]