Подготовка IVT mRNA

Транскрипция in vitro (IVT) является предпочтительным методом для приготовления мРНК, способным давать микрограммы до миллиграммов мРНК в лабораторных условиях. Для исследовательских целей поставщики реактивов разработали гибкие системы реакций IVT, подходящие для мРНК средней длины (1000-4000 нуклеотидов).

В данной статье мы подведем итоги транскрипции мРНК in vitro (IVT), включая традиционную систему реакции IVT, используемую в лабораторных масштабах, и систему реакции IVT, подходящую для сверхдлинной мРНК (>9000 нуклеотидов).

Наборы позволяют осуществлять ко-транскрипционное закрытие с CleanCap AG и снижать иммуногенность с помощью m1ψ. ДНаза I удаляет остаточную ДНК. Низкая выходная продукция может быть вызвана плохим перемешиванием, окислением реагентов или проблемами с ДНК-матрицей, что можно компенсировать центрифугированием, использованием свежих реагентов, контролем и корректировкой количества матрицы/времени реакции.

Yaohai Bio-Pharma предлагает различные готовые продукты IVT RNA (жидкость/лиофилизат) и ЛНП, кодирующие белки, такие как флуоресцентные белки (eGFP, mCHERRY), люцифераза, рекомбиназа Cre и антиген OVA, для удовлетворения различных экспериментальных или проектных потребностей.

Система IVT для ультрадлинного mRNA

Традиционный IVT может не работать для чрезмерно длинного mRNA (>9000 нт). Необходимо глубокое понимание и рациональная настройка компонентов IVT.

ДНК-шаблон: Линеаризованные плазмиды или ПЦР-продукты с соответствующими промоторными последовательностями, растворенные в безRNase H2O. Рекомендуется концентрация ДНК-шаблона выше 40 нМ для оптимальных условий IVT.

ДТТ: Поддерживает активность фермента во время транскрипции. Свежий ДТТ следует добавлять в реакционный буфер для оптимальной активности фермента.

Ингибитор RNase: Подавляет активность RNase и поддерживает стабильность mRNA.

Полимераза T7 RNA: Катализирует транскрипцию ДНК в РНК, соответствующую последовательности промотора. Активность полимеразы T7 зависит от pH и ионов магния.

Ионы магния (Mg2+): Кофактор для РНК-полимеразы. Слишком низкие концентрации снижают эффективность транскрипции, а слишком высокие приводят к деградации РНК. Свободная концентрация [Mg2+] должна регулироваться в зависимости от концентрации нуклеотидов. Каждый нуклеотид связывает один [Mg2+], поэтому концентрация [Mg2+] должна превышать общую концентрацию нуклеотидов.

Нуклеозидтрифосфаты (NTP): Как субстраты, НТП являются базовыми единицами РНК. Концентрации НТП выше 7 mM положительно влияют на производство мРНК.

Спермидин: Стабилизирует ДНК-ферментные комплексы и стимулирует транскрипционные реакции; однако избыточные концентрации оказывают тормозящее действие. Рекомендуемая концентрация спермина составляет от 1 до 3 mM.

Неорганическая пирофосфатаза (PPase): Добавлено в реакции IVT для предотвращения накопления ионов органического пирофосфата (PPi), избегая их хелатирование с Mg2+ и обеспечивая достаточное количество свободного Mg2+.

Используя передовые технологии и опыт в области IVT мРНК, Yaohai Bio-Pharma предоставляет комплексную услугу по производству IVT РНК, включающую проектирование последовательностей, приготовление IVT РНК (с модификациями m1ψ), циклизацию РНК, очистку, лиофилизацию, инкапсуляцию в ЛНП и контроль качества.

Мы также активно ищем глобальных партнеров среди организаций или частных лиц. Мы предлагаем самое конкурентоспособное вознаграждение в отрасли. Если у вас есть вопросы, не стесняйтесь обращаться к нам: [email protected]