Apļveida mRNS (circRNS) ir plaši izmantota gēnu vai olbaltumvielu funkciju izpētē. Tikmēr tas ir populārs profilaktisko un terapeitisko bioloģisko līdzekļu izstrādē, līdzīgi kā mRNS.
Yaohai Bio-Pharma ir izveidojis cirRNS sintēzes tehnoloģiju kopumu, lai nodrošinātu augstas kvalitātes RNS, piemēram, sekvences izstrādi un optimizāciju, in vitro transkripciju (IVT), cirkularizāciju/ciklizāciju, attīrīšanu un lipīdu nanodaļiņu (LNP) iekapsulēšanu. Visi produkti tiek izlaisti saskaņā ar stingriem kvalitātes kontroles (QC) standartiem.
Salīdzinot ar lineāro mRNS, apļveida RNS (cirRNS) ir stabilāka pēc struktūras un ir galvenais karstais punkts pašreizējos nukleīnskābju zāļu pētījumos. Tam ir plašs pielietojumu klāsts dažādās jomās, neatkarīgi no tā, vai tā ir kodējoša cirRNS vai nekodējoša cirRNS, tostarp profilaktiskās vakcīnas pret infekcijas slimībām, terapeitiskās onkoloģijas vakcīnas, terapeitiskās onkoloģijas zāles, proteīnu aizstājterapija, reģeneratīvā medicīna, šūnu un gēnu terapija (CGT) , molekulārā sūkļa loma un RNS aptamērs.
Process | Izvēles pakalpojums | Informācija par pakalpojumu | Piegādes periods (diena) |
cirRNS sekvences dizains un optimizācija | Kodēšanas secību projektēšana un optimizēšana | CDS kodona optimizācija | 1 |
Nekodēšanas secību projektēšana un optimizēšana | Intronu un eksonu secība, homologās rokas un starplikas dizains un optimizācija | 1-2 | |
Apļveida plazmīdu sagatavošana | Gēnu sintēze | Gēnu sintēze (trešās puses) | 7-10 |
Plazmīdu pastiprināšana | Plazmīdu pastiprināšana | 2 | |
Plazmīdu ekstrakcija | |||
Linearizētu plazmīdu preparāts | Plazmīdu linearizācija un attīrīšana | Plazmīdu linearizācija | 1 |
Linearizācijas DNS attīrīšana | |||
In vitro transkripcija un ciklizācija | In vitro transkripcija un ciklizācija | In vitro transkripcijas un ciklizācijas reakcijas | 1-2 |
RNāzes R gremošana | |||
Optimizācija — pēc izvēles | Reakcijas sastāvs, laika optimizācija | 2-5 | |
cirRNS attīrīšana | Tradicionālā attīrīšanas metode | Litija hlorīda nokrišņi | 1 |
Magnētisko lodīšu attīrīšana | 1 | ||
Ļoti tīra cirRNS attīrīšana | Preparatīvā augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC) | 1-2 | |
Bufera apmaiņa | Ultrafiltrācija | 1 | |
cirRNS liofilizācija | Parauga pildīšana | Pildījumu | 2-3 |
Liofilizācija | Iepriekšēja sasaldēšana | ||
Primārā žāvēšana (sublimācija) | |||
Sekundārā žāvēšana (desorbcija) | |||
cirRNS-LNP iekapsulēšana | LNP iekapsulēšana | Materiālu un šķidrumu pirmapstrāde | 2 |
Mikrofluidisko ierīču sajaukšana | |||
Bufera apmaiņa | Tangenciālās plūsmas filtrēšana | 1 | |
sterilizēts | Filtrācija | ||
Plazmīdu DNS kvalitātes kontrole | Koncentrācija/tīrība | Ultravioletā (UV) spektrofotometrija | 1-2 |
Plazmīdu konformācija | Agarozes gēla elektroforēze (AGE) | ||
Kapilārā elektroforēze (CE) — pēc izvēles | |||
Plazmīdu identificēšana | Restrikcijas enzīmu identifikācija/VECUMS | ||
CirRNS kvalitātes kontrole | Koncentrācija/tīrība | Ultravioletā (UV) spektrofotometrija | - |
Tīrība | Agarozes gēla elektroforēze (AGE)/E-gel | 0.5 | |
HPLC nav obligāta | 1 | ||
CirRNS-LNP kvalitātes kontrole | Iekapsulēšanas efektivitāte | RiboGreen metode | 1 |
Daļiņu lielums | Dinamiskā gaismas izkliede (DLS) | 1 | |
Polidispersitātes indekss | Dinamiskā gaismas izkliede (DLS) | 1 | |
Zeta potenciāls | Dinamiskā gaismas izkliede (DLS) | 1 | |
Uz šūnām balstīts potences tests | Šūnu transfekcija | Šūnu apšuvums, šūnu transfekcija | 4 |
Mērķa proteīna noteikšana | Fluorescences novērošana, Western Blot/ELISA | 1-3 |
Mēs transfektējām uzlaboto zaļo fluorescējošo proteīna cirRNS (eGFP cirRNS), mCherry cirRNS, luciferāzes cirRNS 293T šūnās un atklājām mērķa proteīnu, izmantojot fluorescenci, luminiscējošu vai krāsu signālu, Western blot (WB), ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu (ELISA).
Yaohai Bio-Pharma cirRNS paraugu potences testi uz šūnām