In vitro Σύνθεση mRNA
Τα κύρια συστατικά του mRNA είναι το 5'-cap, το 5'-UTR, το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF), το 5'-UTR και το 5' poly A ουρά, τα οποία είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της λειτουργίας του mRNA. Οι ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει μια ποικιλία μεθόδων για τον εντοπισμό και τη βελτιστοποίηση αλληλουχιών και δομών mRNA.
Η σύνθεση του mRNA πραγματοποιείται με βάση το in vitro μεταγράφημα (IVT) χρησιμοποιώντας γραμμικά πρότυπα DNA, πολυμεράσες RNA (Τ3, Τ7 ή SP6), μη τροποποιημένα ή τροποποιημένα νουκλεοτίδια, ένζυμα και κατάλληλα αντιδραστήρια.
5' Τροποποίηση καπακιού
Οι αλληλουχίες του ώριμου mRNA από ευκαρυοκύτταρα δείχνουν ένα κάλυμμα 7-μεθυλγουανοσίνης (m7G) στο 5' άκρο, το οποίο βελτιώνει τη σταθερότητα του mRNA και την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης. Υπάρχουν δύο γενικές μέθοδοι για τη σύλληψη του mRNA in vitro. Πρώτον, το mRNA μπορεί να καλυφθεί μαζί με το in vitro μεταγραφή προσθέτοντας ένα ανάλογο καπακιού της δομής m7GpppG (π.χ. CleanCap) στο σύστημα IVT. Αυτή η μέθοδος συν-μεταγραφικής κάλυψης παρέχει μια φυσική δομή κάψουλας 5' και αυξάνει την αποτελεσματικότητα κάλυψης σε σχεδόν 90-99%. Δεύτερον, η χαρτογράφηση mRNA μπορεί επίσης να επιτευχθεί με χαρτογράφηση ενζυμικών αντιδράσεων μετά την in vitro αντίδραση μεταγραφής.
Τροποποίηση PolyA
Η ουρά Poly(A) επεκτείνει επίσης τον χρόνο ημιζωής του mRNA in vivo και βελτιώνει την αποτελεσματικότητα μετάφρασης του mRNA. Το μήκος της ενισχυμένης ουράς πολυ(Α) πρέπει να είναι 100-300 νουκλεοτίδια. Επιπλέον, η τροποποιημένη αδενοσίνη αυξάνει τη σταθερότητα της ουράς πολυ Α έναντι της αποικοδόμησης της κυτταρικής RNase. Η ουρά Poly A μπορεί να εισαχθεί με in vitro μεταγραφή χρησιμοποιώντας μήτρα DNA που κωδικοποιεί το poly A, καταλήγοντας έτσι σε ένα συγκεκριμένο μήκος αλληλουχίας πολυ Α. Η ανασυνδυασμένη πολυμεράση πολυ Α μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί με ενζυματική πολυαδενυλίωση μετά από μεταγραφή mRNA.
Τροποποίηση Νουκλεοτιδίων
Οι τροποποιημένοι νουκλεοσίτες μπορούν να αναστείλουν την αναγνώριση και/ή την ενεργοποίηση των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (PRR) και να ενισχύσουν την αποτελεσματικότητα των εμβολίων mRNA με δύο εντελώς διαφορετικούς τρόπους. Η προσθήκη ορισμένων χημικά τροποποιημένων νουκλεοζιτών, συμπεριλαμβανομένης της ψευδουριδίνης (ψ), της 1-μεθυλψευδουριδίνης (m1ψ), της θειουριδίνης (s4U) και της 5-μεθυλκυτοσίνης (m5C) μπορεί να αποτρέψει την ενεργοποίηση του TLR7/8 και άλλων έμφυτων ανοσιακών υποδοχέων, οι οποίοι μειώνουν σημαντικά την ανοσογονικότητα του mRNA.
Σύστημα παράδοσης mRNA
Για να διατηρηθεί η λειτουργία του mRNA, χρειάζεται να εισέλθει στο κυτταρόπλασμα του ξενιστή και να εκφράσει συγκεκριμένα αντιγόνα. Μία από τις πιο δύσκολες προκλήσεις που αντιμετωπίζουν τα εμβόλια και οι θεραπευτικές μέθοδοι mRNA έγκειται στην παροχή mRNA σε κύτταρα-στόχους με επαρκώς υψηλά επίπεδα μετάφρασης, διότι απαιτεί εξαιρετικά συγκεκριμένα και αποτελεσματικά συστήματα χορήγησης mRNA. Έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθούν αρκετοί φορείς παροχής mRNA, συμπεριλαμβανομένων των δενδριτικών κυττάρων (DCs), της πρωταμίνης, των κατιονικών πολυμερών και των κατιονικών λιποσωμάτων.
Τα σύμπλοκα κατιονικών λιπιδίων με mRNA και άλλα παρασκευάσματα μπορούν συλλογικά να σχηματίσουν νανοσωματίδια μεγέθους 80-200 nm που ονομάζονται νανοσωματίδια λιπιδίων (LNPs). Ως ένα από τα πιο προηγμένα συστήματα παροχής mRNA, το LNP περιλαμβάνει ιονίσιμα κατιονικά λιπίδια, φυσικά φωσφολιπίδια, χοληστερόλη και πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG). Αρκετά εμβόλια και θεραπείες RNA (siRNA και mRNA) που έχουν εγκριθεί από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ βασίζονται σε συστήματα χορήγησης LNP.
Η Yaohai Bio-Pharma προσφέρει μία λύση για το RNA
Προσαρμοσμένα Παραδοτέα
|
Βαθμός
|
Παραδοτέα
|
Χαρακτηριστικά
|
Εφαρμογές
|
|
μη GMP
|
Φαρμακευτική Ουσία, mRNA
|
0.1~10 mg (mRNA)
|
Προκλινική έρευνα όπως επιμόλυνση κυττάρων, ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου, μελέτες προ-σταθερότητας, ανάπτυξη σκευασμάτων
|
|
Φαρμακευτικό προϊόν, LNP-mRNA
|
|
GMP, Στειρότητα
|
Φαρμακευτική Ουσία, mRNA
|
10 mg~70 g
|
Ερευνητικό νέο φάρμακο (IND), Εξουσιοδότηση κλινικής δοκιμής (CTA), Προμήθεια κλινικών δοκιμών, Αίτηση βιολογικής άδειας (BLA), Εμπορική προμήθεια
|
|
Φαρμακευτικό προϊόν, LNP-mRNA
|
5000 φιαλίδια ή προγεμισμένες σύριγγες/φυσίγγια
|
EL
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
IT
JA
KO
ΟΧΙ
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
