Τα κυκλικά RNA (circRNAs) ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά ως μη κωδικοποιητικά RNA το 1979. Μόλις το 2015 βρέθηκαν μεταγραμμένα circRNA στο Drosophila, γεγονός που οδήγησε στη μελέτη in vitro circRNAs για θεραπευτικούς και προληπτικούς σκοπούς.
Τα circRNA είναι αυτοδιαστελλόμενα και επομένως δεν έχουν συμβατική δομή όπως 5' καπάκι ή 3' ουρά polyA. Αυτή η δομή τα καθιστά πιο σταθερά και ανθεκτικά σε εξωνουκλεάσες όπως η RNase R.
Στοιχεία δομής του κυκλικού RNA (circRNA)
Το πρότυπο DNA για τη σύνθεση circRNA περιλαμβάνει τυπικά εσωτερική θέση εισόδου ριβοσώματος (IRES), ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) και άλλα που είναι κρίσιμα για την in vitro κυκλοφορία. Για παράδειγμα, σχεδιάσαμε ένα πλασμίδιο ως πρότυπο μεταγραφής in vitro (IVT), το οποίο αποτελείται από βραχίονες ομολογίας, 3' εσώνιο, 3' εξόνιο, IRES, ORF, 5' εξόνιο και 5' ιντρόνιο, για την παρασκευή circRNA με αυτο-μάτισμα μεθόδους.
Το Internal Ribosome Entry Site (IRES) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετάφραση των cirRNAs. Ο ιός εγκεφαλομυοκαρδίτιδας (EMCV) IRES, ο ιός coxsackie B3 (CVB3) IRES, ο ανθρώπινος ρινοϊός B3 (HRV-B3) IRES και άλλα IRES έχουν χρησιμοποιηθεί συνήθως για τη μετάφραση της vitro σύνθεσης των cirRNAs
Η in vivo κυκλοποίηση των γραμμικών προδρόμων circRNA παρέχει ένα σημαντικό βήμα στη σύνθεση circRNA, συνήθως μέσω χημικών, ενζυματικών και διαμεσολαβούμενων από ριβοσώματα μονοπατιών αυτοαντιγραφής. Γνωστή ως ορόσημο στον τομέα, η χημική προσέγγιση για την παραγωγή circRNA, που ξεκίνησε το 1988, δεν χρησιμοποιείται πλέον σήμερα λόγω του υψηλού κόστους, της χαμηλής απόδοσης, του μεγάλου αριθμού υποπροϊόντων και του γεγονότος ότι είναι κατάλληλη μόνο για κυκλοποίηση RNA μήκους έως 70 νουκλεοτιδίων.
Οι ενζυματικές μέθοδοι για την κυκλοποίηση του RNA βασίζονται σε ένζυμα βακτηριοφάγου Τ4 ή ριβοένζυμα όπως Τ4 DNA λιγάση (T4 Dnl 1), T4 RNA λιγάση 1 (T4 Rnl 1) και T4 RNA λιγάση 2 (T4 Rnl 2). Για να σχηματιστεί κυκλικό RNA από ένζυμα βακτηριοφάγων Τ4, τα μονοφωσφορικά νουκλεοσίδια πρέπει να βρίσκονται στο 5' άκρο και να συζευχθούν με την ομάδα ΟΗ στο 3' άκρο του RNA. Επειδή κατά την αντίδραση προστίθενται τριφωσφορικά νουκλεοσίδια, το IVT RNA περιέχει τριφωσφορική γουανοσίνη (GTP) στο 5' άκρο.
Τα ριβοένζυμα είναι αλληλουχίες RNA που προάγουν το αυτο-μάτισμα μετατρέποντας γραμμικά μόρια RNA σε circRNA χωρίς την ανάγκη πρόσθετων ενζύμων. Η διαδικασία αυτοσυναρμολόγησης περιλαμβάνει δύο διαδοχικές αντιδράσεις μετεστεροποίησης σε συγκεκριμένες θέσεις για να διασφαλιστεί ότι σχηματίζονται τα επιθυμητά προϊόντα cirRNA. Η μέθοδος αυτοματισμού ιντρονίων της ομάδας Ι, γνωστή και ως PIE (ενθυλάκωση ιντρονίου και εξωνίου), η οποία επιτρέπει την παραγωγή cirRNA μεγαλύτερα από 5 kb, έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει αποδειχθεί χρήσιμη.
Εφαρμογή του Κυκλικού RNA (circRNA)
Εμβόλια CircRNA
Όπως τα γραμμικά mRNA, τα circRNA μπορούν να μετατραπούν σε ορισμένες πρωτεΐνες στα κύτταρα-στόχους και να προκαλέσουν την ισχυρή χυμική και κυτταρική ανοσία. Πρόσφατα, υπάρχουν ορισμένες ερευνητικές ομάδες που ανέπτυξαν με επιτυχία εμβόλια circRNA για την πρόληψη του COVID-19. Τα αποτελέσματά τους όχι μόνο κατείχαν τα οφέλη των εμβολίων γραμμικού mRNA, αλλά είχαν επίσης καλύτερη σταθερότητα και μεγαλύτερη διάρκεια έκφρασης πρωτεΐνης από το γραμμικό mRNA. Επομένως, τα εμβόλια circRNA μπορούν να προκαλέσουν επαρκείς ανοσολογικές αποκρίσεις ακόμη και σε χαμηλές δόσεις.
Επιπλέον, ορισμένοι ερευνητές πιστεύουν ότι τα εμβόλια circRNA, ως mRNA επόμενης γενιάς, μπορεί να γίνουν αποτελεσματικά εργαλεία στο μέλλον για την καταπολέμηση κοινών ιογενών/βακτηριακών ασθενειών και μεγάλων αναδυόμενων μολυσματικών ασθενειών, καθώς και για τη θεραπεία του καρκίνου και άλλων ασθενειών.
CircRNA στη θεραπεία CAR / TCR-T
Ως πρωτοπόρος στον τομέα του κυκλικού RNA, το ORNA έχει αναπτύξει in situ θεραπεία με χιμαιρικό υποδοχέα αντιγόνου (CAR) για in situ θεραπεία που χρησιμοποιεί με το ORN-101, ένα κυκλικό RNA ενθυλακωμένο με LNP, για τη ρύθμιση των ανοσοκυττάρων σε ασθενείς. Το ORN-101 παρουσιάζει υψηλή έκφραση του CAR που οδηγείται από ένα βελτιστοποιημένο στοιχείο IRES. Σε ζωικά μοντέλα, το ORN-101 αποδείχθηκε ότι προκαλεί καταστολή και καταστροφή όγκου, υποδηλώνοντας ότι οι αντικαρκινικές θεραπείες που βασίζονται στο ORN-101 μπορεί να επηρεάσουν τη συμβατική θεραπεία με κύτταρα CAR-T.
Επιπλέον, οι Zhang et al. αξιολόγησε τη βιωσιμότητα και τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα των circRNAs σε θεραπείες με ειδικούς για αντιγόνο υποδοχείς Τ-κυττάρων (TCR)-T. Σχεδίασαν ένα circRNA που κωδικοποιεί το pp65-TCR-T που στοχεύει τον επίτοπο pp65 του κυτταρομεγαλοϊού (CMV). Επιπλέον, το pp65-TCR αποδεικνύεται ότι εκφράζεται σε πρωτεύοντα Τ κύτταρα για περισσότερες από 7 ημέρες. Επιπλέον, τα κύτταρα circRNA-pp65-TCR-T σκότωναν ειδικά και με συνέπεια καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν pp65- και HLA και επέκτεινε σημαντικά τον χρόνο επιβίωσης των ποντικών.
Φάνηκε επίσης ότι κύτταρα που διαμολύνθηκαν με pp65 circRNA εμφάνισαν καλύτερες ανοσοαποκρίσεις σε σύγκριση με το γραμμικό mRNA.
Yaohai's Bio-Pharma One-Stop CRDMO Solution for Long-Coding RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
ΟΧΙ
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
