Τα Circular RNAs (circRNAs) ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά ως μη κωδικοποιητικά RNA το 1979. Δεν ήταν μέχρι το 2015 που βρέθηκαν μεταγραφές circRNAs στο Drosophila, πράγμα που οδήγησε στη μελέτη των circRNAs in vitro για θεραπευτικούς και προφylaktιkούς σκopούς.
τα circRNAs επεκτείνονται αυτομάτως και επομένως δεν έχουν συνηθισμένη δομή όπως κορυφαίο 5' cap ή πολυA ουρά 3'. Αυτή η δομή τους καθιστά πιο σταθερά και ανθεκτικά σε εξωνυκλάσεις όπως το RNase R.
Στοιχεία Δομής του Circular RNA (circRNA)
Το DNA πρότυπο για τη σύνθεση circRNA συνήθως περιλαμβάνει εσωτερικό τόπο εισόδου ριβοσωμάτων (IRES), ανοικτό πεδίο ανάγνωσης (ORF) και άλλα που είναι κρίσιμα για την κυκλικότητα in vitro. Για παράδειγμα, σχεδιάσαμε ένα πλάσμα ως πρότυπο για την μεταγραφή in vitro (IVT), το οποίο αποτελείται από ομοιότητες, 3’ intron, 3’ exon, IRES, ORF, 5’ exon και 5’ intron, για να προετοιμάσουμε circRNA με μέθοδους αυτοσπλάйσινγκ.
Το Εσωτερικό Τοποθεσιακό Σημείο Ριβοσωματικής (IRES) επιτελεί σημαντικές ρόλες στη μετάφραση των cirRNAs. Το IRES του ιού Encephalomyocarditis (EMCV), το IRES του ιού coxsackievirus B3 (CVB3), το IRES του ανθρώπινου rhinovirus B3 (HRV-B3) και άλλα IRES έχουν χρησιμοποιηθεί συνηθώς για τη μετάφραση της in vitro σύνθεσης των cirRNAs.
Η ενδόζωικη κυκλικοποίηση των γραμμικών προγεννήτριων circRNA αποτελεί μια σημαντική φάση στη σύνθεση των circRNA, συνήθως μέσω χημειωδών, ενζυματικών και ριβοσωματικώς διευθυνόμενων μονοπατιών αυτοαναπαραγωγής. Γνωστή ως μίλιο στον τομέα, η χημειωδής μέθοδος παραγωγής circRNA, που εμφανίστηκε το 1988, δεν χρησιμοποιείται πλέον σήμερα λόγω του υψηλού κόστους, της χαμηλής απόδοσης, του μεγάλου αριθμού παραγωγών και του γεγονότος ότι είναι επιτρεπτή μόνο για την κυκλικοποίηση RNA μέχρι 70 νουκλεοτιδίων μήκους.
Οι ενζυματικές μεθόδοι για την κυκλικοποίηση RNA βασίζονται σε ενζύματα φαγού T4 ή ribozymes όπως η T4 DNA ligase (T4 Dnl 1), η T4 RNA ligase 1 (T4 Rnl 1) και η T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl 2). Για να δημιουργηθεί κυκλικό RNA με τα ενζύματα του φαγού T4, οι μονοφοσφάτες νουκλεοτιδών πρέπει να βρίσκονται στο άκρο 5' και να είναι συνδεδεμένες με την ομάδα OH στο άκρο 3' του RNA. Επειδή προστίθενται τριφοσφάτες νουκλεοτιδών κατά τη διάρκεια της αντιδράσης, το IVT RNA περιέχει γκουανοσίνη τριφοσφάτη (GTP) στο άκρο 5'.
Τα ribozymes είναι ακολουθίες RNA που προωθούν την αυτοσπλάισιν μετατρέποντας γραμμικά RNA μόρια σε circRNA χωρίς την ανάγκη για πρόσθετα ενζύματα. Η διαδικασία αυτοσυνέλεξης περιλαμβάνει δύο διαδοχικές αντιδράσεις transesterification σε συγκεκριμένες θέσεις για να εξασφαλιστεί ότι δημιουργούνται τα επιθυμητά προϊόντα cirRNA. Η μέθοδος αυτοσπλάισιν των ομάδων I intron, επίσης γνωστή ως PIE (εγκαθάλεψη intron και exon), η οποία επιτρέπει την παραγωγή cirRNAs μεγαλύτερων από 5 kb, έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει αποδειχτεί χρήσιμη.
Εφαρμογή του κυκλικού RNA (circRNA)
Εμβολίες circRNA
Όπως τα γραμμικά mRNA, τα circRNA μπορούν να μετατρέπονται σε ορισμένα πρωτεΐνα σε στόχο-κύτταρα και να προκαλούν ισχυρό υγρό και κυτταρικό ανοσοποιητικό απόκριμα. πρόσφατα, ορισμένες ομάδες ερευνών έχουν επιτυχώς αναπτύξει εμβολίες circRNA για την πρόληψη του COVID-19. Τα αποτελέσματά τους δεν έχουν μόνο τα πλεονεκτήματα των εμβολίων με γραμμικό mRNA, αλλά καυχούνται και καλύτερης σταθερότητας και μεγαλύτερης διάρκειας έκφρασης πρωτεΐνων από τα γραμμικά mRNA. Γι' αυτό, οι εμβολίες circRNA μπορούν να προκαλούν αρκετά ανοσοποιητικά αποκρίματα ακόμη και σε χαμηλές δόσεις.
Επιπλέον, μερικοί ερευνητές πιστεύουν ότι οι εμβολίες circRNA, ως επόμενη γενιά mRNA, μπορεί να γίνουν αποτελεσματικά εργαλεία στο μέλλον για την αντιμετώπιση κοινών ιοσωματικών/βακτηριακών νόσων και κύριων εξαίρετων μεταδοτικών νόσων, καθώς και για τη θεραπεία του καρκίνου και άλλων νόσων.
CircRNA στη θεραπεία CAR/TCR-T
Ως πρωτοπόρος στον τομέα του κυκλικού RNA, η ORNA αναπτύσσει θεραπεία εν σιτύ chimeric antigen receptor (CAR) για θεραπεία εν σιτύ που χρησιμοποιεί το ORN-101, ένα LNP-περιεχόμενο κυκλικό RNA, για να διαμορφώσει ανοσολογικά κύτταρα σε ασθενείς. Το ORN-101 παρουσιάζει υψηλή έκφραση του CAR υπό την οδήγηση ενός βελτιωμένου στοιχείου IRES. Σε ζώα μοντέλο, το ORN-101 έδειξε ότι προκαλεί θλίψη και καταστροφή του καρκίνου, υποδηλώνοντας ότι οι με βάση το ORN-101 αντικαρκινικές θεραπείες μπορεί να εμποδίσουν τις συνηθισμένες θεραπείες CAR-T κυττάρων.
Επιπλέον, οι Zhang και συνεργάτες αξιολόγησαν τη βιωσιμότητα και τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα των circRNAs σε θεραπείες TCR-T αντίστοιχων σε αντιγόνο. Σχεδιάσαν ένα circRNA που κωδικοποιεί το pp65-TCR-T στοχεύοντας το αντιγόνο pp65 του κυτομεγάλου ιού (CMV). Επιπλέον, δείχνεται ότι το pp65-TCR εκφράζεται σε πρωταρχικά T κύτταρα για πάνω από 7 ημέρες. Επιπλέον, τα κύτταρα circRNA-pp65-TCR-T σκοτώνουν συγκεκριμένα και συνεχώς τα κύτταρα καρκίνου που εκφράζουν pp65 και HLA και επεκτείνουν σημαντικά τον χρόνο ζωής των ποντικιών.
Επιπλέον, δείχτηκε ότι οι κύτταρες που επιμετροπεύθησαν με pp65 circRNA εξέδειξαν καλύτερες ανοσολογικές απαντήσεις σε σύγκριση με το γραμμικό mRNA.
Yaohai’s Bio-Pharma One-Stop CRDMO Solution for Long-Coding RNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
