Раскрываем секреты высококачественной экстракции плазмид

Извлечение плазмиды критически важно для исследователей. Как векторы генов, плазмиды играют ключевую роль в исследованиях вакцин и генной терапии, где качество имеет значение. Основными факторами качества являются доля суперспиралевидной формы и содержание эндотоксинов. Регулирование различается: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, с <5% линейной/открытой круговой ДНК. Клиенты часто предпочитают ≥95% суперспиралевидной формы. Уровни эндотоксинов следующие: для исследований (>50 ЕД/мкг), трансфекции (<50 ЕД/мкг) и безэンドотоксиновых (<0.1 ЕД/мкг).

Суперспиралевидная ДНК плазмиды

Плазмиды из Escherichia coli включают суперспиралевидную (SC), открытую круговую (OC) и линейную (L) ДНК. Высокая доля SC повышает эффективность трансфекции и экспрессию. Например, трансфекция плазмиды с 85.45% SC на 2.5 раза выше, а экспрессия HGF у плазмиды с 93.28% SC на 1.8 раза выше, что подтверждает превосходство SC ДНК.

Открытая циркулярная ДНК: Когда происходит разрыв одной нити двойной спирали ДНК, суперспиральная структура ослабевает, образуя открытую циркулярную плазмиду большего объема, которая мигрирует медленнее всего при электрофорезе и находится вверху.

Линейная ДНК: Когда обе нити плазмидной ДНК разрываются, образуется линейная структура с относительно меньшим объемом, которая мигрирует быстрее открытой циркулярной ДНК, но медленнее суперспиральной ДНК, занимая второе место.

Суперспиральная ДНК: Две спирали переплетаются, образуя суперспираль на основе спирали ДНК. Она имеет наименьший объем и мигрирует быстрее всего при электрофорезе, находясь внизу.

Количественный анализ пропорции суперспиральной формы

В лабораториях используют электрофорез в агарозном геле (AGE) и Gel-Pro Analyzer для определения пропорции суперспиральной формы по изображениям электрофореза. Одно изображение показывает 97,539% СДНК, а другое — 63,833% СДНК и 36,167% ОДНК (линейная ДНК не видна).

Тайна эндотоксинов в плазмидах

Эндотоксин является компонентом внешнего слоя клеточной стенки грамотрицательных бактерий, выделяемым после гибели или лизе бактерий, содержащим токсичный липополисахарид A. Во время извлечения плазмид эндотоксин попадает в раствор лиза, что влияет на эффективность трансфекции и вызывает неспецифические иммунные реакции, приводя к ложноположительным результатам в экспериментах.

Количественный и качественный анализ эндотоксина

Тест с использованием лизата амебоцитов лимула (LAL) обнаруживает эндотоксин через агглютинацию с 2-кето-3-дезоксиоктавионовой кислотой (KDO) в липополисахариде (LPS). Он является качественным и полуколичественным, указывая на наличие эндотоксина через свертывание или изменение цвета при смешивании с образцами.

Yaohai Bio-Pharma предлагает суперспиралевидные плазмиды без эндотоксинов. Аутсорсинг Yaohai повышает эффективность трансфекции и экспрессии. Поставляемые плазмиды содержат ≥95% СС составляющей (в среднем 85%±10%) и уровни эндотоксина ≤0.1, ≤0.01 или ≤0.005 EU/μg.

Мы также активно ищем глобальных партнеров среди организаций или частных лиц. Мы предлагаем самое конкурентоспособное вознаграждение в отрасли. Если у вас есть вопросы, не стесняйтесь обращаться к нам: [email protected]