Раскрываем секреты высококачественной экстракции плазмид

Извлечение плазмиды имеет решающее значение для исследователей. Как векторы генов, плазмиды жизненно важны в исследованиях вакцин и генной терапии, где качество имеет значение. Ключевые факторы качества включают долю суперспирализации и содержание эндотоксина. Правила различаются: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, с <5% линейной/открытой кольцевой ДНК. Клиенты часто предпочитают ≥95% суперспирализации. Уровни эндотоксина: исследование (>50 EU/мкг), трансфекция (<50 EU/мкг) и отсутствие эндотоксина (<0.1 EU/мкг).

Суперспиральная плазмидная ДНК

Плазмиды Escherichia coli включают суперспиральную (SC), открыто-кольцевую (OC) и линейную (L) ДНК. Высокая доля SC повышает эффективность трансфекции и экспрессию. Например, трансфекция плазмиды SC 85.45% в 2.5 раза выше, а экспрессия HGF плазмиды SC 93.28% в 1.8 раза выше, что подтверждает превосходство ДНК SC.

Открытая кольцевая ДНК: когда одна из цепей двухцепочечной ДНК разрывается, суперспиральная структура становится рыхлой, образуя открытую кольцевую плазмиду большего объема, которая мигрирует медленнее всего во время электрофореза и располагается наверху.

Линейная ДНК: когда обе цепи плазмидной ДНК разрываются, образуется линейная структура с относительно меньшим объемом, которая мигрирует быстрее, чем открытая кольцевая ДНК, но медленнее, чем суперспиральная ДНК, расположенная второй.

Суперспиральная ДНК: Две спирали переплетаются, скручиваясь в суперспиральную структуру на основе спирали ДНК. Она имеет наименьший объем и мигрирует быстрее всего во время электрофореза, располагаясь внизу.

Количественный анализ суперспиральной пропорции

Лаборатории используют электрофорез в агарозном геле (AGE) и анализатор Gel-Pro для оценки суперспиральной пропорции с помощью изображений электрофореза. На одном изображении показано 97.539% ДНК SC, а на другом — 63.833% ДНК SC и 36.167% ДНК OC (линейная ДНК не видна).

Секрет эндотоксина в плазмидах

Эндотоксин — компонент внешнего слоя клеточной стенки грамотрицательных бактерий, высвобождающийся после гибели или лизиса бактерий, содержащий токсичный липополисахарид А. Во время выделения плазмиды эндотоксин попадает в лизирующий раствор, влияя на эффективность трансфекции и вызывая неспецифические иммунные реакции, что приводит к ложноположительным результатам в экспериментах.

Количественный и качественный анализ эндотоксина

Тест на лизат амебоцитов Limulus (LAL) обнаруживает эндотоксин посредством агглютинации с 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислотой (КДО) в липополисахариде (ЛПС). Он является качественным и полуколичественным, указывая на присутствие эндотоксина посредством коагуляции или изменения цвета при смешивании с образцами.

Yaohai Bio-Pharma предлагает суперспиральные плазмиды без эндотоксинов. Аутсорсинг Yaohai повышает эффективность трансфекции и экспрессии. Поставляемые плазмиды имеют долю SC ≥95% (в среднем 85%±10%) и уровни эндотоксинов ≤0.1, ≤0.01 или ≤0.005 EU/мкг.

Мы также активно ищем институциональных или индивидуальных глобальных партнеров. Мы предлагаем самую конкурентоспособную компенсацию в отрасли. Если у вас есть какие-либо вопросы, пожалуйста, свяжитесь с нами: [email protected]