Оптимизация целостности клеток E. coli для производства биофармы

В области биофармацевтики Escherichia coli (E. coli) играет важную роль в качестве хозяина для выражения рекомбинантных белков. Целостность клеток E. coli критически важна для выхода белка, его качества и стоимости производства. Эта целостность в основном связана со структурой и функцией внутренней мембраны (IM) и внешней мембраны (OM).

Yaohai Bio-Pharma обладает 15-летним опытом ферментации E. coli и выражения рекомбинантных белков. Мы используем различные стратегии для поддержания высокой целостности клеток E. coli, при этом выход плазмида превышает 1 г/л в течение цикла культивирования продолжительностью 30 часов. Опираясь на обширный опыт микробного экспрессирования, Yaohai Bio-Pharma вывела несколько эффективных стратегий для контроля и улучшения целостности клеток E. coli во время биофармацевтического производства.

Техники мониторинга целостности клеток E. coli

Цитометрия в потоке: Использует флуоресцентные красители для дифференциации состояний клеток, например, йодид пропида для определения жизнеспособности клеток и SYTO9 для оценки проницаемости ОП. Однако требует высоких затрат на красители и сложные операции.

Колориметрические методы: Отражают лизис клеток за счёт выявления содержания ДНК, активности ферментов и т.д. в супернатанте, например, с использованием набора реагентов PicoGreen и тестов на активность щелочной фосфатазы. Эти методы, однако, трудоёмки и требуют дорогих реактивов.

Высокопроизводительная жидкостная хроматография: Используется для офлайн-определения концентраций внеклеточных продуктов для оценки утечки ОП. Тем не менее, её автоматизация сложна, а время анализа велико.

Вибрационные спектроскопические методы: Такие как ближняя инфракрасная и средняя инфракрасная спектроскопия, которые имеют потенциальные применения, но требуют преодоления проблем спектральной интерференции и анализа данных.

Диэлектрическая спектроскопия: Оценивает целостность мембраны путем измерения импеданса клеточных суспензий, что позволяет осуществлять онлайн-мониторинг в реальном времени. Однако она подвержена влиянию помех, а калибровка затруднена.

Биосенсоры: Могут обнаруживать соединения, выделяемые изнутри клеток или периплазмы, но сталкиваются с проблемами, такими как трудности регенерации датчиков.

Измерение вязкости и плотности: Низкая стоимость и быстрый анализ, но отсутствует специфичность, и для принятия решения необходимо учитывать данные нескольких партий.

Факторы, влияющие на клеточную целостность

Генная инженерия штаммов: Изменяет целостность наружной мембраны (OM) через генную инженерию, например, путем мутации липопротеиновых генов, но может повлиять на рост штамма.

Индукция стресса: Перепроизводство рекомбинантных белков приводит к метаболической нагрузке, влияющей на физиологию клеток. Следовательно, необходима разумная регуляция уровней экспрессии.

Скорость подачи субстрата: Как чрезмерно высокая, так и низкая скорости подачи влияют на лизею клеток и целостность наружной мембраны.

Температура и аэрация: Высокие температуры и низкая доступность кислорода увеличивают стрессовое выражение и утечку ОМ, соответственно, но конкретные эффекты варьируются.

Оsmотика: Используется для высвобождения периплазматических белков, но повреждает жизнеспособность клеток, ограничивая их применение.

Вывод: Будущие исследования должны глубже изучить механизмы и условия ремонта мембраны для точного контроля целостности клеточной мембраны. Оптимизация методов мониторинга и анализ факторов влияния могут улучшить качество продукции, способствуя развитию биофармацевтической промышленности.

Мы также активно ищем глобальных партнеров, как учреждений, так и частных лиц. Мы предлагаем самое конкурентоспособное вознаграждение в отрасли. Если у вас есть вопросы, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам по [email protected]