Использование возможностей стратегии ферментации с подпиткой

Pichia pastoris широко используется в производстве различных гетерологичных белков. Технология ферментации с высокой плотностью клеток (HCDF), реализованная посредством кормления с подпиткой, успешно достигла крупномасштабного производства биофармацевтических препаратов и промышленных ферментов. В точно контролируемых средах использование технологии HCDF позволяет получать высокопродуктивные, высокоактивные и экономически эффективные рекомбинантные белки.

Недавние исследования показывают, что с помощью стратегий HCDF предпринимаются усилия по увеличению производства и активности гетерологичных белков в Pichia pastoris. Технология HCDF позволяет без усилий достигать кластеров клеток высокого уровня в определенных средах, тем самым обеспечивая получение обильных рекомбинантных белков с повышенной активностью и сниженными затратами посредством HCDF. Однако выбор подходящей стратегии HCDF для оптимизации экспрессии высокого уровня специфических белков в Pichia pastoris остается сложной задачей.

Ферментация с высокой плотностью клеток (HCDF)

Pichia pastoris отлично подходит для гетерологичного производства белка, что благоприятствует HCDF в автоматизированных биореакторах. HCDF имеет 3 стадии: партия глицерина, подача и индукция метанола. Yaohai Bio-Pharma может похвастаться более чем десятилетним опытом в микробной ферментации и выполнила более 400 проектов. Компания обладает обширным опытом и хорошо развитой технологией, что позволяет ей использовать различные стратегии HCDF для повышения эффективности производства белка.

Метанол служит как индуктор AOX1, так и источником углерода, но его концентрацию необходимо контролировать, чтобы предотвратить токсичность. Оценка различных стратегий кормления метанолом имеет решающее значение для оптимизации роста Pichia pastoris и экспрессии белка

Стратегия индукции метанола

В стратегии индукции метанола с подпиткой HCDF стратегии индукции на основе состояния охватывают набор методологий управления, которые регулируют дополнительное добавление метанола посредством онлайн/офлайн или прямого/обратного управления. Среди статистических стратегий индукции основными являются μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat и biomass-stat.

1.1 μ-стат

Стратегия μ-stat поддерживает биомассу стабильной, контролируя μ, способствуя воспроизводимости и изучая влияние μ на экспрессию белка. Однако в ней отсутствует прямой контроль метанола и DO, что создает риск накопления и генерации ROS.

1.2 DO-стат

Стратегия DO-stat косвенно регулирует подачу метанола, контролируя растворенный кислород для поддержания оксигенации, но она не фиксирует концентрацию метанола и скорость роста, что может повлиять на изучение экспрессии белка. Оксигенация представляет собой проблему в аэробной ферментации, и хотя добавление чистого кислорода может быть дорогостоящим и токсичным, повышение давления является более экономичным подходом, который также может повысить активность белка.

1.3 Метанол-стат

Неадекватный контроль концентрации метанола накладывает ограничения на стратегии μ-stat и DO-stat. Статистические стратегии метанола, которые работают в режиме вкл/выкл, подвержены колебаниям и не обладают точностью. Напротив, ПИД-регуляторы обеспечивают более точное регулирование концентрации метанола, повышая общую эффективность ферментации.

1.4 Биомасса-стат

Стратегия биомассы-стат определяет взаимосвязь между биомассой и подачей метанола, оптимизируя скорость подачи метанола для повышения выхода белка. Онлайн-мониторинг биомассы более практичен, при этом предпочтительным методом является проточная цитометрия. В масштабе 1000 л оптимизация скорости подачи метанола значительно улучшает активность фермента, выход и производительность, превосходя ферментацию в колбе.

Стратегия совместного кормления

Глицерин, как ингибитор промотора AOX1, должен быть полностью потреблен до индукции метанола, чтобы избежать подавления производства белка. Косубстраты могут усиливать активность фермента, но избыток глицерина может нанести вред росту и экспрессии. Сорбитол, аскорбиновая кислота, маннитол и другие могут заменить глицерин, сокращая протеолиз и время культивирования, а также усиливая экспрессию белка.

Банк штаммов требует принятия соответствующих методов сохранения и размещения в подходящей среде для поддержания стабильности характеристик штаммов. Yaohai Bio-Pharma может выполнить требования по сохранению запасов глицерина (с помощью морозильников сверхнизкой температуры или жидкого азота) и сохранению методом сублимационной сушки дрожжей и E. coli.

Стратегия, основанная на ограничениях

В Pichia pastoris такие ограничивающие условия, как низкий уровень DO, концентрация метанола и ограничение кислорода, усиливают экспрессию рекомбинантного белка. Условия с ограничением кислорода активируют промотор AOX1 посредством накопления метанола, увеличивая выход белка и снижая тепло. Низкотемпературная индукция повышает урожайность, активность, стабильность и жизнеспособность клеток, но увеличивает затраты на охлаждение. Ограничение pH и азота также способствует экспрессии, требуя осторожности, чтобы избежать эксплуатационных проблем. Ограничение азота заметно повышает удельную производительность белка.

Yaohai Bio-Pharma также активно ищет институциональных или индивидуальных глобальных партнеров и предлагает самую конкурентоспособную компенсацию в отрасли. Если у вас есть вопросы, пожалуйста, свяжитесь с нами: [email protected]