Использование потенциала стратегии ферментации методом подачи питательной смеси

Pichia pastoris широко используется в производстве различных гетерологичных белков. Технология ферментации с высокой плотностью клеток (HCDF), реализуемая через подачу питательных веществ в режиме Fed-Batch, успешно достигла масштабного производства биофармацевтических препаратов и промышленных ферментов. В точно контролируемой среде использование технологии HCDF позволяет получать рекомбинантные белки высокой урожайности, активности и экономической эффективности.

Недавние исследования показывают, что благодаря стратегиям HCDF предпринимаются усилия по увеличению производства и активности гетерологичных белков в Pichia pastoris. Технология HCDF позволяет легко достичь высоких концентраций клеточных кластеров в определенных средах, что обеспечивает получение обильных рекомбинантных белков с повышенной активностью и сниженными затратами через HCDF. Однако выбор подходящей стратегии HCDF для оптимизации высокоуровневого выражения конкретных белков в Pichia pastoris остается вызовом.

Ферментация с высокой плотностью клеток (HCDF)

Pichia pastoris превосходит в производстве гетерологических белков, что делает её предпочтительной для HCDF в автоматизированных биореакторах. HCDF имеет 3 этапа: пакетный этап на глицерине, подкормка и индуцирование метанолом. Yaohai Bio-Pharma обладает более чем десятилетним опытом в микробной ферментации и выполнила более 400 проектов. Компания имеет обширные знания и хорошо развитые технологии, позволяющие использовать различные стратегии HCDF для повышения эффективности производства белков.

Метанол служит как индуктором AOX1, так и источником углерода, но его концентрация должна быть под контролем, чтобы избежать токсичности. Оценка различных стратегий подачи метанола критически важна для оптимизации роста Pichia pastoris и экспрессии белков

Стратегия индуцирования метанолом

В стратегии индукции метанолом в методе ферментации с подачей питательной среды (fed-batch HCDF), стратегии индукции на основе состояния включают набор методологий управления, регулирующих дополнительное добавление метанола через управление онлайн/оффлайн или прямое/обратное. Среди статистических стратегий индукции основными являются μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat и biomass-stat.

1.1 μ-stat

стратегия μ-stat поддерживает биомассу постоянной за счет контроля μ, что способствует воспроизводимости и изучению влияния μ на экспрессию белка. Однако она не обеспечивает прямой контроль метанола и DO, что может привести к накоплению метанола и образованию ROS.

1.2 DO-stat

Стратегия DO-stat косвенно регулирует подачу метанола, контролируя растворенный кислород для поддержания оксигенации, но не фиксирует концентрацию метанола и скорость роста, что может повлиять на изучение экспрессии белка. Оксигенация представляет собой вызов при аэробном брожении, и хотя добавление чистого кислорода может быть дорогим и токсичным, увеличение давления является более экономичным подходом, который также может повысить активность белка.

1.3 Methanol-stat

Недостаточный контроль концентрации метанола создает ограничения как для стратегии μ-stat, так и для стратегии DO-stat. Статистические стратегии метанола, работающие в режиме вкл/выкл, подвержены колебаниям и недостаточно точны. В противоположность этому, ПИД-регуляторы предлагают более точное регулирование концентрации метанола, улучшая общую эффективность брожения.

1.4 Biomass-stat

Стратегия biomass-stat определяет взаимосвязь между биомассой и подачей метанола, оптимизируя скорость подачи метанола для повышения выхода белка. Онлайн-мониторинг биомассы является более практичным, с поточным цитометрическим методом как предпочтительным. На уровне 1000 л оптимизация скорости подачи метанола значительно улучшает активность фермента, выход и производительность, превосходя флаконную ферментацию.

Ко-подача стратегия

Глицерин, как ингибитор промотора AOX1, должен быть полностью потреблен перед индукцией метанолом, чтобы избежать подавления продукции белка. Ко-субстраты могут усиливать активность фермента, но избыток глицерина может навредить росту и экспрессии. Сорбитол, аскорбиновая кислота, маннитол и другие могут заменить глицерин, снижая протеолиз и время культивирования, а также улучшая экспрессию белка.

Банк штаммов требует применения подходящих методов сохранения и размещения в подходящей среде для поддержания стабильности характеристик штаммов. Yaohai Bio-Pharma может удовлетворить требования по сохранению глицериновых культур (с помощью сверхнизкотемпературных морозильников или жидкого азота) и методу лиофилизации дрожжей и кишечной палочки.

Стратегия, вызванная ограничениями

В Pichia pastoris ограничительные условия, такие как низкий уровень растворенного кислорода (DO), концентрация метанола и дефицит кислорода, способствуют выражению рекомбинантных белков. Условия с ограниченным содержанием кислорода активируют промотор AOX1 через накопление метанола, увеличивая выход белка при снижении тепловыделения. Индуцирование при низких температурах повышает выход, активность, стабильность и жизнеспособность клеток, но увеличивает затраты на охлаждение. Регулирование pH и ограничение азота также способствуют экспрессии, что требует осторожности для избежания операционных проблем. Ограничение азота значительно повышает специфическую продуктивность белка.

Yaohai Bio-Pharma также активно ищет глобальных партнеров среди учреждений или частных лиц и предлагает наиболее конкурентоспособное вознаграждение в отрасли. Если у вас есть вопросы, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам: [email protected]