Az RNS-prekurzorok szakaszos előállítását illetően általánosan használt módszer az in vitro transzkripció (IVT). Az IVT reakció a T7 promotert tartalmazó linearizált plazmid DNS-t használja templátként, és egy RNS-prekurzort szintetizál nukleozid-trifoszfátokkal (NTP-k) szubsztrátként T7 RNS polimeráz jelenlétében.
Az in vitro ciklizációs módszerek közé tartozik a kémiai ligálás, az enzimatikus ligálás és a permutált intron-exon (PIE) módszer. A kémiai ligálás és az enzimatikus ligálás alkalmas rövidebb RNS-ek ciklizálására. Ha a fragmentum nagyobb, mint 100 nt, a ciklizációs sebesség nagymértékben csökken. Ezzel szemben a PIE rendszeren alapuló nukleáz módszerrel 8 kb méretű szekvenciák ciklizálását lehet elérni.
A guanozin-trifoszfát (GTP) katalízise során a PIE szerkezete az extra-intron szekvenciák ciklizálásán megy keresztül. A ciklizációs sebesség növelésére irányuló ésszerű stratégiával kombinálva a Yaohai Bio-Pharma akár 4 kb méretű szekvenciák ciklizálását is elérheti, több mint 80%-os ciklizálási hatékonysággal.
Az RNS in vitro ciklizációs reakciója a következőképpen zajlik:
Az RNS prekurzort in vitro transzkripcióval szintetizálják, és a PIE komponens a GTP katalízise alatt fejezi be az önillesztést, hogy cirRNS-t képezzen.
Szolgáltatások részletei
| folyamat |
Szolgáltatás részletei |
Szállítási időszak (munkanap) |
| In vitro transzkripció és keringés |
Reakciórendszer megerősítése |
1-2 |
| In vitro transzkripciós és ciklizációs reakciók |
| RNáz R emésztés |
| Reakció optimalizálás |
Reakció összetétel, idő optimalizálás |
2-5 |
Jellemzők
- Szigorú teszttervezés és optimalizálás
Akár 4 kb RNS ciklizálás érhető el.
- Magas ciklizálási hatékonyság
A racionális szekvenciaoptimalizálási stratégiával több mint 80%-os ciklizációs arány érhető el.
- Az RNáz szigorú szabályozása
A kísérleti környezetben és a fogyóeszközökben az RNázok szigorú szabályozása révén az RNS lebomlása hatékonyan megelőzhető.
Esettanulmány
A cirRNS in vitro ciklizálása és dúsítása
A PIE rendszer alapján a Yaohai Bio-Pharma optimalizálta a cirkRNS szekvenciáját, agaróz gélelektroforézissel (AGE) több mint 80%-os ciklizációs sebességgel. Az RNáz R felhasználásával a cirRNS dúsítására az E-gél elektroforézis eredményei azt mutatják, hogy a lineáris RNS-prekurzor megemésztődik, és további tisztítás után a bevágott cirRNS nagy része eltávolítható. A tisztító oldatot a Yaohai Bio-Pharma saját fejlesztésű.
In vitro keringés és cirRNS dúsítása
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NEM
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
