A Yaohai Bio-Pharma a circRNA-t a PIE rendszeren (exonok és intronok igazítása) alapulóan készíti el, amely a típus I intronok saját magukat összevágó funkcióján alapszik az RNA ciklizálásához. A PIE szerkezetet a T4 td géngenező vagy a hal tRNA-előd gén használatával tervezzük, és a következő sorrendben rendezzük:
Az RNA intron és támogató exon szakaszt két részre osztjuk (5' vég és 3' vég), ahol a 5' vég sorozatát a cél sorozat vége elé helyezzük, a 3' vég sorozatot pedig a cél sorozat elejéhez illesztjük, középen beszúrva a célgén sorozatot.
A GTP-katalizis alatt a PIE struktúra intronoktól különböző sorozatok ciklizációjához vezet. Egy megfelelő ciklizációs sebesség növelési stratégia kombinálásával a Yaohai Bio-Pharma túl 80%-os ciklizációs arányban elérheti a legfeljebb 4 kb hosszúságú sorozatok ciklizációját.
Ábra 1. circRNA in vitro ciklizálása a PIE rendszer alapján
A folyamat | Opcionális Szolgáltatás | Szolgáltatás részletei | Szállítási Idő (munkanap) |
circRNA sorozat tervezése és optimalizálása | Kódoló sorozatok tervezése és optimalizálása |
CDS sorozat igazítása CDS kódot optimalizálása |
1 |
Nem kódoló szekvensek tervezése és optimalizálása |
Intron és exon sorozat tervezése és optimalizálása Homológus kar sorozat tervezése és optimalizálása Távolsági sorozat tervezése és optimalizálása |
1-2 |
CircRNA komponensek | Biológiai függvények | Optimalizálási stratégiák | |
Kétvégű intron és exon sorozatok | GTP-katalizált intron önmagolása a sorozatok ciklikusítására az intronon kívül. | Tervezték a T4 td gének vagy a halolaj tRNA előd-gének alapján. | |
Kódolás | IRES | Belső riboszomásis felismerési hely, amely szabályozza a circRNA fordítását. | Belső riboszom belépési hely (IRES) sorozatok szűrése különböző vírusforrásokból, például EMCV, CVB3 forrásokból. |
CDS | Fémbelvárkódoló régiók, sorozatok, amelyek antigensek, antitestek vagy más funkcionális fehérjék kódolásáért felelnek. | A kodonoptimalizálás növeli a fordítás szintjét; bizonyos nem optimális kodonok lehet, hogy szerepet játszanak a fehérjegyenesítésben. | |
Nem kódoló | Nem kódoló sorozatok | Cél miRNÁkat vagy fehérjéket a gén- vagy fehérje-szabályozás megvalósítására. | A miRNAs vagy fehérjék specifikus kötési helyeire való célozás újra felhasználhatja a kötési hely sorozatát. |
A Yaohai Bio-Pharma kontrolltermékként az erősített zöld fluoreszcens fehérje (eGFP) circRNA-t indította, amely a PIE rendszeren alapulva elérhető az RNA ciklizálása.
Egy konvencionális transzfekciós üzemanyaggal az eGFP circRNA transzfekálva a 293T sejtbe, és 24 órával eGFP (zöld) fluoreszcens jelet észlelhetnek, amely 48 órával megnövekszik. A fluoreszcens jel észlelhető továbbra is a transzfekció utáni hetedik és tizenegyedik napon.
In vitro kifejezéses validáció az eGFP circRNA-ra