Data z peptidového mapování pomocí kapalné chromatografie - hmotnostní spektrometrie (LC-MS) poskytnou velké množství informací o primární a vyšší struktuře přirozených a rekombinantních bílkovin, včetně pokrytí aminokyselinové sekvence, posttranslačních modifikací (PTM, např. glykosylace, oxidace, deamidace), disulfidových vazeb atd.
Yaohai Bio-Pharma nabízí služby analýzy peptidového mapování pro váš cílový protein pomocí LC-MS, aby se urychlil váš výzkum struktury bílkovin.
Angažujeme se v charakterizaci struktury bílkovin různých velkých molekul, včetně rekombinantních podjednotkových vakcín, nanotěles/VHHs/jednodoménových antitěl (sdAbs), fragmentů antitěl, hormonů/peptidů, cytokinů, růstových faktorů (GF), enzymů, kolagenů atd.
Regulační požadavky na peptidové mapování
ICHQ6B pokyn doporučuje: „Vybrané rozdělení produkty na diskrétní peptidy je prováděno pomocí vhodných enzymů nebo chemikálií a výsledné peptidové fragmenty jsou analyzovány pomocí HPLC nebo jiné vhodné analytické metody. Peptidové fragmenty by měly být identifikovány ve všech možných případech pomocí technik, jako je analýza aminokyselinového složení, N-koncové sekvenace nebo masové spektrometrie (MS). Peptidové mapování látky či léčivého produktu (DP) pomocí vhodně validované metody je často používáním způsobem pro potvrzení požadované struktury produktu pro uvolnění dávky.“
Analytické metody
| Analýza |
Metody |
| Mapování peptidů |
Proteasové trávení a kapalná chromatografie-masová spektrometrie (LC-MS) |
Analytický postup
1. Redukce a alkylování
Účelem je snížit disulfidové mosty a blokovat vzniklé volné thiolové skupiny. Redukce disulfidových mostů pomáhá otevřít proteinovou strukturu, čímž se enzymatická hydrolyza stává efektivnější. Tento krok také přeruší mosty mezi řetězci u víceřetězcových proteinů, které mají disulfidové mosty spojující řetězce (např. monoclonální antitěla, mAbs).
2. Hydrolyza proteinu enzymy
Účelem je rozložit protein na peptidy. Enzymy vybíráme na základě teoretického pořadí aminokyselin v proteinu a znalosti teoretické enzymatické hydrolyzy tohoto proteinu. Výběr enzymů touto metodou by měl vést ke nejlepší peptidové mapovací analýze.
3. Analýza hydrolyzovaných peptidů Pomocí on-line reverzní fáze - vysokorychlostní kapalné chromatografie s ultrafialovým (UV) a elektrospray-masově spektrometrickým detekcí (LC/ES-MS).
Oddělení peptidů podle polarity pomocí LC (reverzní fáze-LC)
Když peptid uniká z kolony LC, spektrometr hmotnosti vygeneruje hmotnostní informace spolu s informacemi o fragmentačních iontech, což nám umožňuje určit sekvenci. Používáme tuto sekvenci k potvrzení identity peptidu a poskytnutí primárních informací.
Můžeme také generovat fragmentační informace z peptidů, jak vstupují do zdroje spektrometru hmotnosti z kolony LC. V závislosti na požadavcích studie je to buď selektivní LC-MS/MS nebo neoselektivní, což lze považovat za formu tandemového MS.
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
