Mapovací data peptidů založená na kapalinové chromatografii a hmotnostní spektrometrii (LC-MS) poskytnou velké množství informací o primární struktuře a struktuře nativních a rekombinantních proteinů vyššího řádu, včetně pokrytí aminokyselinové sekvence, posttranslačních modifikací (PTM, např. glykosylace). oxidace, deamidace), disulfidové vazby atd.
Yaohai Bio-Pharma nabízí služby analýzy peptidového mapování pro váš cílový protein pomocí LC-MS, aby se urychlil váš výzkum struktury proteinu.
Podíleli jsme se na proteinové strukturní charakterizaci různých velkých molekul, včetně rekombinantních podjednotkových vakcín, nanoprotilátek/VHH/jednodoménových protilátek (sdAbs), fragmentů protilátek, hormonů/peptidů, cytokinů, růstových faktorů (GF), enzymů, kolagenů, atd.
Regulační požadavky na mapování peptidů
Směrnice ICHQ6B doporučuje: „Selektivní fragmentace produktu na diskrétní peptidy se provádí pomocí vhodných enzymů nebo chemikálií a výsledné peptidové fragmenty se analyzují pomocí HPLC nebo jiného vhodného analytického postupu. Peptidové fragmenty by měly být identifikovány pokud možno pomocí technik, jako je analýza složení aminokyselin, N-terminální sekvenování nebo hmotnostní spektrometrie (MS). Peptidové mapování účinné látky nebo lékového produktu (DP) pomocí vhodně validované metody je metoda často používaná k potvrzení požadované struktury produktu pro uvolňování šarží.
Analytické metody
| Analýza |
Metody |
| Mapování peptidů |
Digesce proteáz a kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC-MS) |
Analytický postup
1. Redukce a alkylace
Účelem je redukce disulfidových můstků a blokování generovaného volného thiolu. Redukce disulfidových můstků pomáhá otevřít proteinovou strukturu, což zefektivňuje proteolytické trávení. Tento krok také přeruší můstky mezi řetězci v případě víceřetězcových proteinů, které mají disulfidové můstky spojující řetězce (např. monoklonální protilátky，mAb).
2. Trávení proteinu pomocí enzymů
Účelem je rozložit protein na peptidy. Enzymy jsme zvolili na základě teoretické sekvence proteinu a znalosti teoretického štěpení proteinu enzymy. Výběr enzymů tímto způsobem by měl vést k nejlepší analýze mapování peptidů.
3. Analýza štěpených peptidů Použití on-line reverzní fázově vysoce výkonné kapalinové chromatografie s ultrafialovou (UV) a elektrosprejovou hmotnostní spektrometrickou detekcí (LC/ES-MS).
Separace peptidů na základě polarity pomocí LC (reverzní fáze-LC)
Když se peptid eluuje z LC kolony, bude hmotnostní spektrometr generovat informace o hmotnosti spolu s informacemi o fragmentových iontech, což nám umožňuje určit informaci o sekvenci. Informace o sekvenci používáme k potvrzení identity peptidu a poskytnutí primární informace.
Můžeme také generovat informace o fragmentaci z peptidů, když vstupují do zdroje hmotnostního spektrometru z LC kolony. V závislosti na požadavcích studie se jedná buď o selektivní LC-MS/MS nebo neselektivní, kterou lze považovat za formu tandemové RS.
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
