การเตรียม mRNA ของ IVT

การถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT) เป็นวิธีที่ต้องการในการเตรียม mRNA ซึ่งสามารถให้ mRNA ได้ในระดับไมโครกรัมถึงมิลลิกรัมในระดับห้องปฏิบัติการ เพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัย ซัพพลายเออร์รีเอเจนต์ได้พัฒนาระบบปฏิกิริยา IVT อเนกประสงค์ที่เหมาะสำหรับ mRNA ที่มีความยาวปานกลาง (1000-4000 นิวคลีโอไทด์)

ในบทความนี้ เราจะสรุปการถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT) ของ mRNA รวมถึงระบบปฏิกิริยา IVT ทั่วไปที่ใช้ในระดับห้องปฏิบัติการและระบบปฏิกิริยา IVT ที่เหมาะสำหรับ mRNA ที่ยาวเป็นพิเศษ (>9000 นิวคลีโอไทด์)

ชุดทดสอบช่วยให้สามารถปิดการถอดรหัสร่วมด้วย CleanCap AG และลดภูมิคุ้มกันด้วย m1ψ DNase I กำจัด DNA ที่เหลือ ผลผลิตต่ำอาจเกิดจากการผสมที่ไม่ดี การเกิดออกซิเดชันของรีเอเจนต์ หรือปัญหาเทมเพลต DNA ซึ่งสามารถบรรเทาได้ด้วยการปั่นเหวี่ยง รีเอเจนต์ใหม่ ตัวควบคุม และการปรับปริมาณเทมเพลต/เวลาปฏิกิริยา

Yaohai Bio-Pharma จัดหาผลิตภัณฑ์ IVT RNA สำเร็จรูปต่างๆ (ผงของเหลว/แช่แข็งแห้ง) และผลิตภัณฑ์สำเร็จรูป LNP ที่เข้ารหัสโปรตีน เช่น โปรตีนเรืองแสง (eGFP, mCHERRY), ลูซิเฟอเรส, รีคอมบิเนส Cre และแอนติเจน OVA เพื่อตอบสนองความต้องการในการทดลองหรือโครงการที่แตกต่างกัน

ระบบ IVT สำหรับ mRNA ที่ยาวเป็นพิเศษ

IVT ทั่วไปอาจใช้ไม่ได้กับ mRNA ที่ยาวเกินไป (>9000 nt) จำเป็นต้องมีความเข้าใจอย่างลึกซึ้งและการปรับส่วนประกอบของ IVT อย่างมีเหตุผล

แม่แบบ DNA: พลาสมิดเชิงเส้นหรือผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีลำดับโปรโมเตอร์ที่สอดคล้องกัน ละลายในน้ำที่ปราศจาก RNase แนะนำให้ใช้ความเข้มข้นของเทมเพลต DNA สูงกว่า 2 nM สำหรับสภาวะ IVT ที่เหมาะสมที่สุด

ดีทีที: รักษาการทำงานของเอนไซม์ระหว่างการถอดรหัส ควรเติม DTT ใหม่ลงในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาเพื่อให้เอนไซม์มีการทำงานที่เหมาะสมที่สุด

สารยับยั้ง RNase: ยับยั้งกิจกรรมของ RNase และรักษาเสถียรภาพของ mRNA

โพลิเมอร์อาร์เอ็นเอ T7: เร่งปฏิกิริยาการถอดรหัส DNA เป็น RNA ที่สอดคล้องกับลำดับโปรโมเตอร์ กิจกรรมของ T7 RNA polymerase ได้รับผลกระทบจาก pH และไอออนแมกนีเซียม

ไอออนแมกนีเซียม (Mg2+): โคแฟกเตอร์สำหรับ RNA โพลิเมอเรส ความเข้มข้นที่ต่ำเกินไปจะลดประสิทธิภาพการถอดรหัส ในขณะที่ความเข้มข้นที่สูงเกินไปจะนำไปสู่การย่อยสลายของ RNA ควรปรับ [Mg2+] อิสระตามความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์ นิวคลีโอไทด์แต่ละตัวจะจับกับ [Mg2+] หนึ่งตัว ดังนั้นความเข้มข้นของ [Mg2+] ควรเกินความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมด

นิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต (NTP): NTP เป็นหน่วยพื้นฐานของ RNA ที่เป็นสารตั้งต้น ความเข้มข้นของ NTP ที่สูงกว่า 7 mM จะส่งผลดีต่อการผลิต mRNA

สเปอร์มิดีน: ทำให้คอมเพล็กซ์ DNA-เอนไซม์มีเสถียรภาพและกระตุ้นปฏิกิริยาการถอดรหัส อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่มากเกินไปจะมีผลยับยั้ง ความเข้มข้นของสเปอร์มิดีนที่แนะนำคือระหว่าง 1 ถึง 3 มิลลิโมลาร์

ไพโรฟอสฟาเตสอนินทรีย์ (PPase): เพิ่มเข้าไปในปฏิกิริยา IVT เพื่อป้องกันการสะสมของไอออนไพโรฟอสเฟตอนินทรีย์ (PPi) หลีกเลี่ยงการคีเลตกับ Mg2+ และเพื่อให้แน่ใจว่ามี Mg2+ อิสระเพียงพอ

Yaohai Bio-Pharma ใช้เทคโนโลยีล้ำสมัยและประสบการณ์ด้าน IVT mRNA เพื่อมอบบริการ IVT RNA ครบวงจร ซึ่งครอบคลุมถึงการออกแบบลำดับ การเตรียม IVT RNA (ด้วยการปรับเปลี่ยน m1ψ) การสร้างวงแหวน RNA การทำให้บริสุทธิ์ การทำแห้งแบบแช่แข็ง การห่อหุ้ม LNP และการทดสอบคุณภาพ

นอกจากนี้เรายังกระตือรือร้นในการแสวงหาพันธมิตรระดับสถาบันหรือรายบุคคลทั่วโลก เราเสนอค่าตอบแทนที่แข่งขันได้มากที่สุดในอุตสาหกรรม หากคุณมีคำถามใด ๆ โปรดติดต่อเรา: [email protected]