การเตรียม mRNA โดย IVT

การถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT) เป็นวิธีที่ได้รับความนิยมสำหรับการเตรียม mRNA ซึ่งสามารถให้ผลผลิตเป็นไมโครกรัมถึงมิลลิกรัมของ mRNA ในระดับห้องปฏิบัติการ เพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัย ผู้จัดจำหน่ายสารละลายได้พัฒนาระบบปฏิกิริยา IVT ที่หลากหลาย ซึ่งเหมาะสำหรับ mRNA ที่มีความยาวปานกลาง (1000-4000 นิวคลีโอไทด์)

ในบทความนี้ เราจะสรุปเกี่ยวกับการถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT) ของ mRNA รวมถึงระบบปฏิกิริยา IVT แบบเดิมที่ใช้ในระดับห้องปฏิบัติการ และระบบปฏิกิริยา IVT ที่เหมาะสมสำหรับ mRNA ที่มีความยาวมากกว่า (>9000 นิวคลีโอไทด์)

ชุดเครื่องมือช่วยให้เกิดกระบวนการปิดห่วงโซ่ขณะถอดรหัสพร้อมกับ CleanCap AG และลดความเป็นภูมิคุ้มกันต่อต้านด้วย m1ψ DNase I กำจัด DNA เศษที่เหลืออยู่ การให้ผลผลิตต่ำอาจเกิดจาก การผสมที่ไม่ดี สารละลายเกิดออกซิเดชัน หรือปัญหาของแม่พิมพ์ DNA ซึ่งสามารถแก้ไขได้โดยการหมุนเหวี่ยง การใช้สารละลายใหม่ การควบคุม และปรับปริมาณแม่พิมพ์/เวลาปฏิกิริยา

Yaohai Bio-Pharma ให้บริการผลิตภัณฑ์ RNA ที่สังเคราะห์ในหลอดทดลอง (รูปแบบของเหลว/ผงแห้งเย็น) และผลิตภัณฑ์ LNP สำเร็จรูป โดยมีโปรตีนที่เข้ารหัส เช่น โปรตีนเรืองแสง (eGFP, mCHERRY), ลูซิเฟอเรส, เรคอมไบเนส Cre และแอนติเจน OVA เพื่อตอบสนองต่อความต้องการของการทดลองหรือโครงการที่แตกต่างกัน

ระบบ IVT สำหรับ mRNA ที่ยาวมาก

IVT ปกติอาจไม่สามารถใช้งานได้กับ mRNA ที่ยาวเกินไป (>9000 nt) จำเป็นต้องมีความเข้าใจอย่างลึกซึ้งและการปรับเปลี่ยนองค์ประกอบของ IVT อย่างเหมาะสม

แม่พิมพ์ DNA: พลาสมิดที่ถูกตัดเส้นตรงหรือผลิตภัณฑ์ PCR พร้อมลำดับโปรตีเมอร์ที่สอดคล้อง ละลายใน H2O ที่ปราศจาก RNase แนะนำให้มีความเข้มข้นของแม่พิมพ์ DNA สูงกว่า 40 nM เพื่อเงื่อนไข IVT ที่เหมาะสมที่สุด

DTT: รักษาการทำงานของเอนไซม์ระหว่างกระบวนการทรานสคริปชัน ควรเติม DTT ที่สดใหม่ลงในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาเพื่อรักษากิจกรรมของเอนไซม์ให้อยู่ในระดับที่ดีที่สุด

สารยับยั้ง RNase: ยับยั้งการทำงานของ RNase และรักษาเสถียรภาพของ mRNA

โพลีเมอเรส RNA T7: เร่งปฏิกิริยาการถอดแบบดีเอ็นเอเป็นอาร์เอ็นเอ ซึ่งสอดคล้องกับลำดับพรอมอเตอร์ การทำงานของโพลิเมอเรส T7 RNA ได้รับผลกระทบจากค่า pH และไอออนแมกนีเซียม

ไอออนแมกนีเซียม (Mg2+): โคแฟกเตอร์สำหรับโพลิเมอเรส RNA ความเข้มข้นที่ต่ำเกินไปจะลดประสิทธิภาพของการถอดแบบ ในขณะที่ความเข้มข้นที่สูงเกินไปอาจทำให้ RNA เสื่อมสภาพ [Mg2+] ฟรีควรปรับตามความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์ แต่ละนิวคลีโอไทด์จับกับ [Mg2+] หนึ่งโมเลกุล ดังนั้นความเข้มข้นของ [Mg2+] ควรมากกว่าความเข้มข้นรวมของนิวคลีโอไทด์

ไนโตรไซด์ทริฟอสเฟต (NTP): ในฐานะสารพื้นฐาน NTP เป็นหน่วยพื้นฐานของ RNA ความเข้มข้นของ NTP สูงกว่า 7 mM จะมีผลเชิงบวกต่อการผลิต mRNA

สเปอร์มิดีน: ช่วยคงเสถียรภาพของคอมเพล็กซ์ DNA-เอนไซม์และกระตุ้นปฏิกิริยาการถอดแบบ อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่มากเกินไปอาจมีผลยับยั้ง ความเข้มข้นของสเปอร์มิดีนที่แนะนำอยู่ระหว่าง 1 ถึง 3 mM

ไพโรฟอสเฟเทสในอินทรียวัตถุ (PPase): เพิ่มลงในปฏิกิริยา IVT เพื่อป้องกันการสะสมของไอออนไพรูฟเฟต์อนินทรีย์ (PPi) หลีกเลี่ยงการจับคู่กับ Mg2+ และรับประกันว่าจะมี Mg2+ ที่ไม่ผูกพันเพียงพอ

ด้วยเทคโนโลยีชั้นนำและประสบการณ์ด้าน mRNA IVT Yaohai Bio-Pharma ให้บริการ RNA IVT แบบครบวงจร ครอบคลุมการออกแบบลำดับ DNA การเตรียม RNA IVT (พร้อมการแก้ไข m1ψ) การหมุนเวียน RNA การกรอง การทำแห้งเย็น การห่อหุ้ม LNP และการทดสอบคุณภาพ

เราได้ดำเนินการค้นหาพันธมิตรระดับโลกทั้งหน่วยงานหรือบุคคลทั่วไปอย่างแข็งขัน เราเสนอค่าตอบแทนที่แข่งขันได้มากที่สุดในอุตสาหกรรม หากคุณมีคำถามใด ๆ กรุณาติดต่อเราได้โดยตรง: [email protected]