Priprava IVT mRNA

Transkripcija v vitro (IVT) je priljubljena metoda za pripravo mRNA, ki lahko zagotovi mikrogramov do miligramov mRNA na laboratorijski ravni. Za raziskovalne namene so dobavitelji sredstev razvili fleksibilne IVT reakcijske sisteme, primerne za mRNA srednje dolžine (1000-4000 nukleotidov).

V tem članku bomo povzeli transkripcijo v vitro (IVT) mRNA, vključno s konvencionalnim IVT reakcijskim sistemom, uporabljenim na laboratorijski ravni, ter IVT reakcijskim sistemom, primeranim za ultra-dolgo mRNA (>9000 nukleotidov).

Sestavine omogočajo kove šapiranje z CleanCap AG in zmanjšanje imunogenosti z m1ψ. DNase I odstrani ostanke DNA. Nizka izdata je lahko posledica slabe mešanja, oksidacije sredstev ali problemov z DNS predložkom, kar se da zmanjšati s centrifugiranjem, svežimi sredstvi, nadzori in prilagajanjem količine predložka/reakcijskega časa.

Yaohai Bio-Pharma ponuja različne predhodno pripravljene IVT RNA produkte (tekočina/zamrznjen prah) in zaključne LNP produkte, ki kodirajo proteine, kot so fluorescenčni proteini (eGFP, mCHERRY), luciferaza, rekombinaza Cre in antigen OVA, da izpolnijo različne eksperimentalne ali projektna potrebe.

IVT Sistem za ultra-dolgo mRNA

Običajni IVT morda ne deluje za preveč dolge mRNA (>9000 nt). Zahteva se globoko razumevanje in racionalna prilagoditev IVT komponent.

DNA šablon: Linearni plazmidi ali PCR produkti z odgovarajučimi promotorji sekvencami, otopljeni v RNase brez H2O. Priporočena je koncentracija DNA šablona višja od 40 nM za optimalne pogoje IVT.

DTT: Ohranja aktivnost enzima med transkripcijo. Sveži DTT je treba dodati v reakcijski buffer za optimalno aktivnost enzima.

RNase inhibitor: Inhibira aktivnost RNase in ohranja stabilnost mRNA.

T7 RNA polimeraza: Katalizira transkripcijo DNA v RNA, ki odgovarja promotorjski sekvenci. Aktivnost polimeraze T7 RNA je vplivana s pH in magnezijevimi ioni.

Magnezijeviioni (Mg2+): Kofaktor za polimerazo RNA. Prenizke koncentracije zmanjšajo učinkovitost transkripcije, medtem ko previsoke koncentracije vodijo do degradacije RNA. Prosta [Mg2+] mora biti prilagojena glede na koncentracijo nukleotidov. Vsak nukleotid vezne en [Mg2+], zato mora koncentracija [Mg2+] preseči skupno koncentracijo nukleotidov.

Nukleozidne trifosfatne kisline (NTP): Kot substracti so NTP osnovni gradniki RNA. Koncentracije NTP nad 7 mM imajo pozitiven vpliv na proizvodnjo mRNA.

Spermidin: Stabilizira DNA-enzimski kompleks in spodbuja transkripcijske reakcije; vendar pa imajo previsoke koncentracije tovornega vpliva. Priporočena koncentracija spermidina je med 1 in 3 mM.

Inorganična pirofosfataza (PPase): Dodatek v IVT reakcijah, da se prepreči kumulacija jonov neorgančnega pirofosfata (PPi), zato da se izognemo njihovi kompleksaciji s Mg2+ in zagotovimo dovolj prostega Mg2+.

S posredovanjem vodilne tehnologije in izkušenj s IVT mRNA ponuja Yaohai Bio-Pharma enočasno storitev IVT RNA, ki vsebuje načrtovanje zaporedij, pripravo IVT RNA (z m1ψ spremembami), ciklizacijo RNA, očiščevanje, zamehljenje, oklepanje v LNP in kakovostno testiranje.

Prav tako aktivno iščemo globalne partnerje, institucije ali posameznike. Ponujamo največje naknadne plačilo v industriji. Če imate katere koli vprašanja, nas prosimo, da nas svobodno kontaktirate: [email protected]