Priprava mRNA IVT

Transkripcija in vitro (IVT) je prednostna metoda za pripravo mRNA, ki lahko v laboratorijskem merilu proizvede mikrograme do miligramov mRNA. Za raziskovalne namene so dobavitelji reagentov razvili vsestranske reakcijske sisteme IVT, primerne za mRNA zmerne dolžine (1000-4000 nukleotidov).

V tem članku bomo povzeli in vitro transkripcijo (IVT) mRNA, vključno z običajnim reakcijskim sistemom IVT, ki se uporablja v laboratoriju, in reakcijskim sistemom IVT, primernim za ultra-dolgo mRNA (>9000 nukleotidov).

Kompleti omogočajo kotranskripcijsko zapiranje s CleanCap AG in zmanjšujejo imunogenost z m1ψ. DNaza I odstrani preostalo DNK. Nizek izkoristek je lahko posledica slabega mešanja, oksidacije reagenta ali težav s šablono DNK, ki jih je mogoče ublažiti s centrifugiranjem, svežimi reagenti, kontrolami in prilagajanjem količine/reakcijskega časa šablone.

Yaohai Bio-Pharma ponuja različne montažne izdelke IVT RNA (tekočina/zamrznjeno posušen prah) in končne izdelke LNP, ki kodirajo proteine, kot so fluorescentni proteini (eGFP, mCHERRY), luciferaza, rekombinaza Cre in antigen OVA, za izpolnjevanje različnih eksperimentalnih ali projektnih potrebe.

Sistem IVT za ultra dolgo mRNA

Konvencionalna IVT morda ne bo delovala pri predolgi mRNA (>9000 nt). Potrebno je poglobljeno razumevanje in racionalna prilagoditev komponent IVT.

Predloga DNK: Linearizirani plazmidi ali produkti PCR z ustreznimi promotorskimi sekvencami, raztopljeni v H2O brez RNaze. Za optimalne pogoje IVT je priporočljiva koncentracija predloge DNA, višja od 40 nM.

DTT: Ohranja encimsko aktivnost med transkripcijo. Za optimalno encimsko aktivnost je treba reakcijskemu pufru dodati svež DTT.

Zaviralec RNaze: Zavira aktivnost RNaze in ohranja stabilnost mRNA.

T7 RNA polimeraza: Katalizira transkripcijo DNA v RNA, ki ustreza zaporedju promotorja. Na aktivnost RNA polimeraze T7 vplivajo pH in magnezijevi ioni.

Magnezijevi ioni (Mg2+): Kofaktor za RNA polimerazo. Prenizke koncentracije zmanjšajo učinkovitost prepisovanja, previsoke koncentracije pa povzročijo razgradnjo RNA. Prosti [Mg2+] je treba prilagoditi glede na koncentracijo nukleotidov. Vsak nukleotid kelatira en [Mg2+], zato mora koncentracija [Mg2+] presegati skupno koncentracijo nukleotidov.

Nukleozidni trifosfati (NTP): Kot substrati so NTP osnovne enote RNK. Koncentracije NTP nad 7 mM pozitivno vplivajo na proizvodnjo mRNA.

Spermidin: Stabilizira DNA-encimske komplekse in spodbuja transkripcijske reakcije; vendar imajo prevelike koncentracije zaviralne učinke. Priporočena koncentracija spermidina je med 1 in 3 mM.

Anorganska pirofosfataza (PPaza): Dodan reakcijam IVT za preprečevanje kopičenja anorganskih pirofosfatnih ionov (PPi), izogibanje njihovemu keliranju z Mg2+ in zagotavljanje zadostne količine prostega Mg2+.

Yaohai Bio-Pharma s pomočjo pionirske tehnologije in izkušenj z mRNA IVT zagotavlja storitev IVT RNA na enem mestu, ki zajema zasnovo zaporedja, pripravo IVT RNA (z modifikacijami m1ψ), ciklizacijo RNA, čiščenje, liofilizacijo, inkapsulacijo LNP in testiranje kakovosti.

Aktivno iščemo tudi institucionalne ali individualne globalne partnerje. Ponujamo najbolj konkurenčno nadomestilo v panogi. Če imate kakršna koli vprašanja, nas kontaktirajte: [email protected]