Uporaba moči strategije fermentacije Fed-batch

Pichia pastoris je široko uporabljana v proizvodnji različnih heterolognih beljakovin. Tehnologija visoke gostote celic (High-Cell-Density Fermentation, HCDF), implementirana prek hrane Fed-Batch, je uspešno dosegli velikomerni proizvodnji biofarmacevtskih sredstev in industrijskih enzimov. V natančno nadzogenih sredinah omogoča uporaba tehnologije HCDF doseganje visoko učinkovitosti, visoke aktivnosti in cenovno učinkovitih rekombinantnih beljakovin.

Nedavne raziskave pokažejo, da prek strategij HCDF poskušajo povečati proizvodnjo in aktivnost heterolognih beljakovin v Pichia pastoris. Tehnologija HCDF omogoča enostavno doseženo visoko stopnjo celičnih skupin v določenih sredinah, kar omogoča pridobitev obilnih rekombinantnih beljakovin z povečano aktivnostjo in zmanjšanimi stroški prek HCDF. Vendar pa ostaja izziv izbira ustreznega strategija HCDF za optimizacijo visoke izražene specifičnih beljakovin v Pichia pastoris.

Fermentacija z visoko gostoto celic (High-Cell-Density Fermentation, HCDF)

Pichia pastoris izteka v proizvodnji heterolognih beležin, pri čemer je priljubljena za HCDF v avtomatiziranih bioreaktorjih. HCDF ima 3 faze: serijsko glecerolno, hrano in metanolno indukcijo. Yaohai Bio-Pharma si pochlubi več kot desetletjem izkušenj v mikrobiološki fermentaciji in je sodelovala v več kot 400 projektih. Podjetje razpolaga z obsežno strokovnostjo in dobro razvitimi tehnologijami, kar mu omogoča uporabo različnih strategij HCDF za izboljšanje učinkovitosti proizvodnje beležin.

Metanol služi hkrati kot induktor AOX1 in vir ogljikov, vendar mora biti njegova koncentracija nadzorovana, da se izognemo toksičnosti. Vredno je oceniti različne strategije hrane z metanolom, saj so ključne za optimizacijo rasti Pichia pastoris in ekspresije beležin.

Strategija metanolne indukcije

V strategiji indukcije metanolom s pomočjo serijskega nakrmitev HCDF so državne strategije indukcije skupina kontrolnih metodologij, ki urejajo dodatno dodajo metanolov prek vmesnika ali naprej/obratno. Med statističnimi strategijami indukcije so glavne μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat in biomass-stat.

1.1 μ-stat

strategija μ-stat ohranja stabilno biomaso z upravljanjem μ, kar pomaga pri ponovljivosti in študiju vpliva μ na izraz proteina. Vendar pa ne vsebuje neposredne kontrole metanolov in DO, kar lahko povzroči akumulacijo in generiranje ROS.

1.2 DO-stat

Strategija DO-stat posredno regulira davanje metanol, tako da nadzira disjonski kisek, da ohrani oksigenacijo, vendar ne določa koncentracije metanol in rasti, kar lahko vpliva na študijo izražanja beljakovin. Oksigenacija predstavlja izziv pri aerobni fermentaciji, saj je dopolnitev z čistim kisikom lahko strošna in toksična, povečanje tlaka pa je ekonomičnejši pristop, ki lahko tudi poveča aktivnost beljakovin.

1.3 Methanol-stat

Nedostatan nadzor koncentracije metanol postavlja omejitve za obe strategiji μ-stat in DO-stat. Metanolske statistične strategije, ki delujejo v na/off načinu, so podvržene oscilacijam in pomanjkljive natančnosti. V nasprotju s tem ponujajo PID regulatorji boljšo natančno regulacijo koncentracije metanol, kar povečuje učinkovitost fermentacije.

1.4 Biomasa-stat

Strategija biomass-stat določa povezavo med biomaso in hranjenjem metanolu, pri čemer se optimizira hitrost hranjenja metanolu za povišanje izhoda proteina. Spletno spremljanje biomase je bolj praktično, pri čemer je metoda plavinske citometrije priljubljena. Pri merili 1000 litrov znatno izboljšanje hitrosti hranjenja metanolu poveča dejavnost enzima, izhod in proizvodnost, presegajoči ferментacijo v flasah.

Strategija skupnega hranjenja

Glicerol, kot inhibitor promotorja AOX1, mora biti popolnoma porabljen pred indukcijo z metanolom, da se izognemo potiskovanju proizvodnje proteina. Skupni substracti lahko povečajo dejavnost enzima, vendar pa lahko presežek glicerola škoduje rastem in izrazu. Sorbitol, askorbna kislina, manitol in drugi lahko zamenjajo glicerol, zmanjšajo peptidolozijske procese, čas kultiviranja in povečajo izraz proteina.

Banka štrikov zahteva uporabo ustreznih metod ohranjanja in postavljanje v primerno okolje, da se ohrani stabilnost lastnosti štrikov. Yaohai Bio-Pharma lahko izpolni zahteve za ohranjanje glicerolnih zalog (s pomočjo ultra-nizkotemperaturnih hladilnikov ali tekoče azota) in za sušenje pod mrazom za ohranjanje kvasinki in E. coli.

Strategija s omejitvijo

V Pichia pastoris povečajo omejujoče pogoje, kot so nizka DO, koncentracija metanolova in omejitev kisika, izraz rekombinantnih beležin. Pogoji z omejeno kisikom aktivirajo promotor AOX1 prek akumulacije metanolova, kar poveča izdelavo beležin, hkrati pa zmanjša toploto. Indukcija pri nizkih temperaturah poveča izdelavo, dejavnost, stabilnost in življenjsko sposobnost celic, vendar poveča tudi stroške hlađenja. Omejitev pH in azota prispeva tudi k izražanju, pri čemer je potrebno pozorno spremljati, da se izognemo operacijskim težavam. Omejitev azota zlasti poveča specifično proizvodnost beležine.

Yaohai Bio-Pharma aktivno išče tudi institucionalne ali posamezne globalne partnerje in ponuja najbolj konkurenčno nakazilo v industriji. Če imate katere koli vprašanje, prosimo, da nas kontaktirate: [email protected]