Izkoriščanje moči strategije šaržne fermentacije Slovenija

Pichia pastoris se pogosto uporablja pri proizvodnji različnih heterolognih beljakovin. Tehnologija fermentacije visoke celične gostote (HCDF), ki se izvaja s serijskim hranjenjem, je uspešno dosegla obsežno proizvodnjo biofarmacevtskih izdelkov in industrijskih encimov. V natančno nadzorovanih medijih lahko z uporabo tehnologije HCDF pridobimo rekombinantne proteine ​​z visokim izkoristkom, visoko aktivnostjo in stroškovno učinkovitimi.

Nedavne raziskave kažejo, da si s strategijami HCDF prizadevamo povečati proizvodnjo in aktivnost heterolognih beljakovin v Pichii pastoris. Tehnologija HCDF omogoča enostavno doseganje celičnih grozdov na visoki ravni v definiranih medijih, s čimer omogoča pridobitev obilice rekombinantnih proteinov z izboljšano aktivnostjo in zmanjšanimi stroški prek HCDF. Vendar ostaja izbira ustrezne strategije HCDF za optimizacijo visoke ravni izražanja specifičnih beljakovin v Pichia pastoris še vedno izziv.

Fermentacija z visoko gostoto celic (HCDF)

Pichia pastoris se odlikuje po heterologni proizvodnji beljakovin, prednostni za HCDF v avtomatiziranih bioreaktorjih. HCDF ima 3 stopnje: serijo glicerola, hranjenje in indukcijo metanola. Yaohai Bio-Pharma se ponaša z več kot desetletnimi izkušnjami na področju mikrobne fermentacije in je služila več kot 400 projektom. Podjetje ima obsežno strokovno znanje in dobro razvito tehnologijo, ki mu omogoča uporabo različnih strategij HCDF za izboljšanje učinkovitosti proizvodnje beljakovin.

Metanol služi kot induktor AOX1 in vir ogljika, vendar je treba njegovo koncentracijo nadzorovati, da preprečimo toksičnost. Vrednotenje različnih strategij hranjenja z metanolom je ključnega pomena za optimizacijo rasti Pichia pastoris in izražanja beljakovin

Strategija indukcije metanola

V strategiji indukcije metanola HCDF s šaržnim napajanjem strategije indukcije na podlagi stanja zajemajo nabor metodologij nadzora, ki uravnavajo dodatno dodajanje metanola prek spletnega/brez povezave ali krmiljenja naprej/nazaj. Med statističnimi indukcijskimi strategijami glavne vključujejo μ-stat, raztopljeni kisik (DO)-stat, metanol-stat in biomaso-stat.

1.1 μ-stat

Strategija μ-stat ohranja biomaso enakomerno z nadzorom μ, pomaga pri ponovljivosti in preučuje učinek μ na izražanje beljakovin. Vendar pa nima neposrednega nadzora nad metanolom in DO, kar tvega kopičenje in nastajanje ROS.

1.2 DO-stat

Strategija DO-stat posredno uravnava dovajanje metanola z nadzorom raztopljenega kisika za vzdrževanje oksigenacije, vendar ne določa koncentracije metanola in stopnje rasti, kar lahko vpliva na študij izražanja beljakovin. Oksigenacija predstavlja izziv pri aerobni fermentaciji, in medtem ko je dodajanje čistega kisika lahko drago in strupeno, je povečanje tlaka bolj ekonomičen pristop, ki lahko poveča tudi aktivnost beljakovin.

1.3 Metanol-stat

Neustrezen nadzor koncentracije metanola predstavlja omejitve tako za strategije μ-stat kot DO-stat. Statistične strategije metanola, ki delujejo v načinu vklop/izklop, so nagnjene k nihanjem in premalo natančne. Nasprotno pa PID regulatorji ponujajo natančnejšo regulacijo koncentracije metanola, kar poveča splošno učinkovitost fermentacije.

1.4 Statistika biomase

Strategija biomase-stat opredeljuje razmerje med biomaso in dovajanjem metanola ter optimizira hitrost dovajanja metanola za povečanje izkoristka beljakovin. Spletno spremljanje biomase je bolj praktično, pri čemer je prednostna metoda pretočna citometrija. Na lestvici 1000 L optimizacija hitrosti dovajanja metanola znatno izboljša encimsko aktivnost, izkoristek in produktivnost ter tako prekaša fermentacijo v bučki.

Strategija sočasnega hranjenja

Glicerol, kot zaviralec promotorja AOX1, je treba v celoti porabiti pred indukcijo metanola, da preprečimo zatiranje proizvodnje beljakovin. Kosubstrati lahko povečajo aktivnost encimov, vendar lahko presežek glicerola škodi rasti in izražanju. Sorbitol, askorbinska kislina, manitol in drugi lahko nadomestijo glicerol, zmanjšajo proteolizo in čas gojenja ter povečajo izražanje beljakovin.

Banka sevov zahteva sprejetje ustreznih metod konzerviranja in namestitev v primerno okolje za ohranitev stabilnosti značilnosti seva. Yaohai Bio-Pharma lahko izpolni zahteve za konzerviranje zalog glicerola (prek zamrzovalnikov z ultra nizko temperaturo ali tekoči dušik) in konzerviranje z zamrzovanjem in sušenjem kvasa in E. coli.

Strategija, ki jo povzročajo omejitve

Pri Pichia pastoris omejevalni pogoji, kot so nizek DO, koncentracija metanola in omejitev kisika, povečajo izražanje rekombinantnih beljakovin. Pogoji, omejeni s kisikom, aktivirajo promotor AOX1 prek kopičenja metanola, kar poveča proizvodnjo beljakovin in hkrati zmanjša toploto. Indukcija pri nizki temperaturi poveča donos, aktivnost, stabilnost in sposobnost preživetja celic, vendar doda stroške hlajenja. Omejitev pH in dušika prav tako pomaga pri izražanju, kar zahteva previdnost, da se izognemo operativnim težavam. Omejitev dušika zlasti poveča specifično produktivnost beljakovin.

Yaohai Bio-Pharma prav tako aktivno išče institucionalne ali individualne globalne partnerje in ponuja najbolj konkurenčno nadomestilo v industriji. Če imate kakršna koli vprašanja, nas kontaktirajte: [email protected]