Инновационные методы сборки для синтеза генов большого масштаба

Технология сборки для синтеза больших фрагментов ДНК с нуля является основой синтеза генов, включая методы, такие как BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, сборка по Гибсону, CPEC и Overlap PCR. Из-за ограничений современных технологий в точном синтезе ДНК длиной гена за один шаг необходимо комбинировать in vitro и in vivo техники сборки для объединения олигонуклеотидных фрагментов, синтезированных по частям, в длинные фрагменты ДНК.

Техники in vitro сборки

Они классифицируются на различные методы в зависимости от размера фрагмента и характеристик последовательности, с общей потребностью в использовании инструментальных энзимов. Перекрывающаяся ПЦР, основанная на методе ДНК-полимеразы, проста и быстра в исполнении. Методы BioBrick и BglBrick, которые зависят от изосхизомеров, позволяют стандартизированную сборку, хотя метод BioBrick не подходит для фьюз-белков. Метод клонирования Golden Gate, основанный на типе IIS рестрикционных энзимов, позволяет эффективное бесшовное лигирование нескольких фрагментов. Метод сборки Gibson, который использует комбинацию нескольких инструментальных энзимов, обеспечивает бесшовное лигирование с размерами фрагментов, достигающими нескольких сотен кб. Стандартизированный дизайн компонентов ДНК повышает использование существующих фрагментов.

Техники in vivo сборки

Хотя в vitro сборка фрагментов может достигать нескольких сотен кб по размеру, выход часто бывает недостаточным, что требует усиления с помощью организмов, таких как Escherichia coli. При сборке фрагментов, превышающих 20 кб, часто используются рекомбинантные системы внутри организмов, включая Bacillus subtilis, дрожжи и модифицированные бактерии. Дрожжи, как часто используемый хост, давно известны своей эффективной способностью гомологичной рекомбинации. Их можно использовать для сборки искусственных хромосом длиной до нескольких мегабаз (Mb). Кроме того, Saccharomyces cerevisiae демонстрирует исключительную терпимость к длине хромосом, что создает теоретическую основу для использования дрожжей при построении сверхдлинных хромосом у высших организмов.

Применения

Yaohai Bio-Pharma в основном использует два метода сборки для синтеза генов: сборку лигазой и сборку ДНК-полимеразой. Метод лигазной сборки соединяет перекрывающиеся и гибридизированные олигонуклеотидные фрагменты с 5'-фосфатом в двуспиральную ДНК с помощью лигазы ДНК. Метод полимеразной сборки использует ДНК-полимеразу для удлинения перекрывающихся олигонуклеотидных фрагментов через гибридизацию, получая смесь различных длин, и в конечном итоге усилит успешно собранные фрагменты полной длины с помощью праймеров. Yaohai может помочь клиентам удовлетворить специфические требования при синтезе генов.

Мы также активно ищем глобальных партнеров среди организаций или частных лиц. Мы предлагаем самое конкурентоспособное вознаграждение в отрасли. Если у вас есть вопросы, не стесняйтесь обращаться к нам: [email protected]