Инновационные методы сборки для крупномасштабного синтеза генов

Технология сборки для синтеза больших фрагментов ДНК с нуля является краеугольным камнем генного синтеза, охватывая такие методы, как BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, сборка Гибсона, CPEC и Overlap PCR. Из-за ограничений современных технологий в точном синтезе ДНК генной длины за один шаг необходимо объединить методы сборки in vitro и in vivo для сборки олигонуклеотидных фрагментов, синтезированных сегментами, в длинные фрагменты ДНК.

Методы сборки in vitro

Они классифицируются по различным методам на основе размера фрагмента и характеристик последовательности с общим требованием использования инструментальных ферментов. Перекрывающаяся ПЦР, основанная на методе ДНК-полимеразы, проста и быстра в работе. Методы BioBrick и BglBrick, которые основаны на изошизомерах, обеспечивают стандартизированную сборку, хотя метод BioBrick не подходит для белков слияния. Метод клонирования Golden Gate, основанный на ферментах рестрикции типа IIS, обеспечивает эффективное бесшовное лигирование нескольких фрагментов. Метод сборки Гибсона, который использует комбинацию нескольких инструментальных ферментов, обеспечивает бесшовное лигирование с размерами фрагментов, достигающими нескольких сотен кб. Стандартизированный дизайн компонентов ДНК повышает скорость использования существующих фрагментов.

Методы сборки in vivo

Несмотря на то, что в пробирке собранные фрагменты могут достигать размера в несколько сотен кб, выход часто недостаточен, что требует амплификации с использованием таких организмов, как Кишечная палочка. При сборке фрагментов, превышающих 20 кб, часто используются рекомбинантные системы внутри организмов, включая Bacillus subtilis, дрожжи и сконструированные бактерии. Дрожжи, как широко используемый хозяин, уже много лет известны своей эффективной способностью к гомологичной рекомбинации. Их можно использовать для сборки искусственных хромосом длиной до нескольких мегабаз (Мб). Кроме того, Saccharomyces cerevisiae демонстрирует необычайную толерантность к длине хромосом, что дает теоретическую основу для использования дрожжей для построения сверхдлинных хромосом в высших организмах.

Приложения

Yaohai Bio-Pharma в основном использует два метода сборки для синтеза генов: сборку лигазой и сборку ДНК-полимеразой. Метод сборки лигазой соединяет перекрывающиеся и гибридизированные 5'-фосфорилированные олигонуклеотидные фрагменты в двухцепочечную ДНК с использованием ДНК-лигазы. Метод сборки полимеразой использует ДНК-полимеразу для удлинения перекрывающихся олигонуклеотидных фрагментов посредством гибридизации, получения смеси разной длины и, наконец, амплификации успешно собранных полноразмерных фрагментов с использованием праймеров. Yaohai может помочь клиентам удовлетворить особые требования в области синтеза генов.

Мы также активно ищем институциональных или индивидуальных глобальных партнеров. Мы предлагаем самую конкурентоспособную компенсацию в отрасли. Если у вас есть какие-либо вопросы, пожалуйста, свяжитесь с нами: [email protected]