Yaohai Bio-Pharma מכינה circRNA על בסיס מערכת PIE (העתקה של אקסונים ואינтроны), שמשתמשת בפונקציית ההפרדה העצמית של אינטרונים מסוג I כדי להשיג ציקליזציה של RNA. מבנה PIE מעוצב באמצעות גן T4 td או הגן המקדים של tRNA דג, והסדר הוא כדלקמן:
האינטרון של RNA והחתך האקסוני התומך מחולקים לשני חלקים (קצה 5' וקצה 3'), שבו הסדר של הקצה 5' הועבר לסוף הסדרה המטרה, הסדר של הקצה 3' נסחט לפני הסדרה המטרה, והסדרת הגן המטרה נכנסת באמצע.
תחת הקטליזה של GTP, המבנה PIE מוביל לציקליזציה של סדרות שאינן אינטרונים. יחד עם אסטרטגיה תקיפה להגברת קצב הציקליזציה, Yaohai Bio-Pharma יכולה להשיג ציקליזציה של סדרות באורך של עד 4 ק"ב עם קצב ציקליזציה של יותר מ-80%.
תמונה 1. חיקוי מחוץ לגוף של circRNA מבוסס על מערכת PIE
תַהֲלִיך | שירות אופציונלית | פרטי שירות | תקופת מסירה (יום עבודה) |
עיצוב ותמצית של סדרת circRNA | עיצוב ותאמה של סדרות קידודיות |
השוואת סדרת CDS הופטימיזציה של קדון CDS |
1 |
עיצוב ותיכנון של סדרות לא-קודדות |
עיצובת וoptimization של סדרות אינטרון ואקסון DESIGN ו-optimization של סדרת זרוע הומולוגית DESIGN ו-optimization של סדרה מרווחת |
1-2 |
רכיבי CircRNA | פונקציות ביולוגיות | אסטרטגיות אופטימיזציה | |
סדרות אינטרון ואקסון דו-طرفיות | ספlicing עצמי של אינטרון המניע GTP לציקליזציה של הסדרות מחוץ לאינטרון. | נוצרו לפי גן T4 td או הגן המקדים ל-tRNA של שמן דגים. | |
קידוד | IRES | אתר זיהוי ריבוזום פנימי שמשלט על תרגום circRNA. | סינון של סדרות אתר כניסה של ריבוזום פנימי (IRES) ממקורות ויראליים שונים, למשל EMCV, מקורות CVB3. |
CDS | אזורים המוצגים בחלבונים, סדרות המצגות אנטיגנים, חיסונים או חלבונים פונקציונליים אחרים. | הופטימיזציה של קודונים מגבירה את רמת התרגום; קודונים מסוימים שאינם אופטימליים עשויים לשחק תפקיד בהרכבת החלבון. | |
לא-מוצגים | סדרות לא-מוצגות | מטרתם של miRNAs או חלבונים היא להפעיל שליטה בגן או בחלבון. | הכוונה לאתרים ספציפיים של חיבור ל-miRNAs או חלבונים יכולה לחזור על הסדרות של אתר החיבור. |
Yaohai Bio-Pharma הוציאה את המוצר הבסיסי פלורסנט ירוק מוגבר (eGFP) circRNA, שהוא מבוסס על מערכת PIE כדי להשיג את הציקליזציה של RNA.
באמצעות חומר העברה סטנדרטי, circRNA eGFP מועבר לתאים 293T, ואות פלורסנטי של eGFP (ירוק) יכול להיות זוהה לאחר 24 שעות, והוא יגבר לאחר 48 שעות. האות הפלורסנטי עדיין יכול להיות זוהה ביום השביעי והיום הארבעה עשר לאחר ההעברה.
אימות ביטוי in vitro של circRNA eGFP