Los datos de mapeo de péptidos basados en Cromatografía Líquida-Espectrometría de Masas (LC-MS) proporcionarán una gran cantidad de información sobre la estructura primaria y de orden superior de proteínas nativas y recombinantes, incluyendo la cobertura de la secuencia de aminoácidos, modificaciones post-traduccionales (MPT, por ejemplo, glicosilación, oxidación, desamidación), enlaces disulfuro, etc.
Yaohai Bio-Pharma ofrece servicios de análisis de mapeo de péptidos para su proteína objetivo mediante LC-MS, para acelerar su investigación sobre la estructura de proteínas.
Hemos estado involucrados en la Caracterización Estructural de Proteínas de varias grandes moléculas, incluidas Vacunas Recombinantes de Subunidades, Nanocuerpos/VHHs/ Antibodies de Dominio Único (sdAbs), Fragmentos de Antibody, Hormonas/Péptidos, Citocinas, Factores de Crecimiento (GF), Enzimas, Colágenos, etc.
Requisitos Regulatorios para el Mapeo de Péptidos
La guía ICHQ6B recomienda: “La fragmentación selectiva del producto en péptidos discretos se realiza utilizando enzimas o químicos adecuados y los fragmentos péptidos resultantes se analizan por cromatografía de fase líquida de alta presión (HPLC) u otro procedimiento analítico apropiado. Los fragmentos péptidos deben identificarse lo más posible utilizando técnicas como el análisis de la composición de aminoácidos, la secuenciación N-terminal o espectrometría de masas (MS). El mapeo péptido de la sustancia activa o el producto farmacéutico (DP) mediante un método validado apropiadamente es un método a menudo utilizado para confirmar la estructura del producto deseado para la liberación del lote.”
Métodos Analíticos
| Análisis |
Métodos |
| Mapeo de Péptidos |
Digestión con Proteasa y Cromatografía Líquida-Espectrometría de Masas (LC-MS) |
Procedimiento Analítico
1. Reducción y Alquilación
El objetivo es reducir los puentes de disulfuro y bloquear el tiol libre generado. La reducción de los puentes de disulfuro ayuda a abrir la estructura de la proteína, lo que hace que la digestión proteolítica sea más eficiente. Este paso también romperá los puentes entre las cadenas en el caso de proteínas multicadenas que tienen puentes de disulfuro que unen las cadenas (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, mAbs).
2. Digestión de la Proteína Usando Enzimas
El objetivo es descomponer la proteína en péptidos. Elegimos los enzimas basándonos en la secuencia teórica de la proteína y el conocimiento de la digestión teórica de la proteína por enzimas. Al elegir enzimas de esta manera, debería resultar en el mejor análisis de mapeo de péptidos.
3. Análisis de los Péptidos Digestados Usando Cromatografía Líquida de Fase Inversa de Alto Rendimiento en Línea con Detección Ultravioleta (UV) y Espectrometría de Masas por Electrospray (LC/ES-MS).
Separación de péptidos basada en la polaridad usando LC (fase inversa-LC)
A medida que el péptido se eluye de la columna de LC, el espectrómetro de masas generará información de masa junto con información de iones fragmento, lo que nos permite determinar la información de secuencia. Usamos la información de secuencia para confirmar la identidad del péptido y proporcionar información primaria.
También podemos generar la información de fragmentación de los péptidos cuando entran en la fuente del espectrómetro de masas desde la columna de LC. Dependiendo de los requisitos del estudio, esto puede ser LC-MS/MS selectivo o no selectivo, lo cual se puede considerar como una forma de MS tandem.
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