Los datos de mapeo de péptidos basados en cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) proporcionarán una gran cantidad de información sobre la estructura primaria y de orden superior de proteínas nativas y recombinantes, incluida la cobertura de secuencias de aminoácidos, modificaciones postraduccionales (PTM, por ejemplo, glicosilación , oxidación, desamidación), enlaces disulfuro, etc.
Yaohai Bio-Pharma ofrece servicios de análisis de mapeo de péptidos para su proteína objetivo mediante LC-MS, para acelerar su investigación sobre la estructura de las proteínas.
Hemos estado involucrados en la caracterización estructural de proteínas de varias moléculas grandes, incluidas vacunas de subunidades recombinantes, nanocuerpos/VHH/anticuerpos de dominio único (sdAb), fragmentos de anticuerpos, hormonas/péptidos, citocinas, factores de crecimiento (GF), enzimas, colágenos. etc.
Requisitos reglamentarios para el mapeo de péptidos
La directriz ICHQ6B recomienda: “La fragmentación selectiva del producto en péptidos discretos se realiza utilizando enzimas o productos químicos adecuados y los fragmentos de péptidos resultantes se analizan mediante HPLC u otro procedimiento analítico apropiado. Los fragmentos de péptidos deben identificarse en la medida de lo posible mediante técnicas como el análisis de la composición de aminoácidos, la secuenciación N-terminal o la espectrometría de masas (MS). El mapeo peptídico del principio activo o producto farmacéutico (DP) utilizando un método validado apropiadamente es un método que se utiliza a menudo para confirmar la estructura deseada del producto para la liberación del lote”.
Métodos analíticos
| Analisis |
Métodos |
| Mapeo de péptidos |
Digestión con proteasas y cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) |
Procedimiento analítico
1. Reducción y alquilación
El propósito es reducir los puentes disulfuro y bloquear el tiol libre generado. La reducción de los puentes disulfuro ayuda a abrir la estructura de la proteína, lo que hace que la digestión proteolítica sea más eficiente. Este paso también romperá los puentes entre las cadenas en el caso de proteínas de cadenas múltiples que tienen puentes disulfuro que unen las cadenas (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, mAb).
2. Digestión de la proteína mediante enzimas
El objetivo es descomponer la proteína en péptidos. Elegimos las enzimas basándonos en la secuencia teórica de la proteína y el conocimiento de la digestión teórica de la proteína por enzimas. La elección de las enzimas de esta manera debería dar como resultado el mejor análisis de mapeo de péptidos.
3. Análisis de los péptidos digeridos. Uso de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa en línea con detección espectrométrica de masas por ultravioleta (UV) y electropulverización (LC/ES-MS).
Separación de péptidos basada en la polaridad mediante LC (fase inversa-LC)
A medida que el péptido eluye de la columna LC, el espectrómetro de masas generará información de masa junto con información de iones fragmentados, lo que nos permite determinar la información de secuencia. Utilizamos la información de la secuencia para confirmar la identidad del péptido y proporcionar información primaria.
También podemos generar la información de fragmentación de los péptidos a medida que ingresan a la fuente del espectrómetro de masas desde la columna LC. Dependiendo de los requisitos del estudio, se trata de LC-MS/MS selectiva o no selectiva, que puede considerarse como una forma de MS en tándem.
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