La ocupación del sitio de N-glicosilación es una característica fisiológica de las glicoproteínas y produce principalmente N-glicanos. El servicio de análisis de ocupación del sitio de N-glicosilación de Yaohai Bio-Pharma se lleva a cabo mediante digestión, liberación, enriquecimiento y análisis utilizando Cromatografía Líquida-Electroniebulización Ionización Espectrometría de Masas-Espectrometría de Masas (LC-ESI-MS/MS).
Hemos estado involucrados en la Caracterización Estructural de Proteínas de varias grandes moléculas, incluidas Vacunas Recombinantes de Subunidades, Nanocuerpos/VHHs/ Antibodies de Dominio Único (sdAbs), Fragmentos de Antibody, Hormonas/Péptidos, Citocinas, Factores de Crecimiento (GF), Enzimas, Colágenos, etc.
Requisitos Regulatorios para la Ocupación del Sitio de N-glicosilación
De acuerdo con la directriz ICH Q6B, “para las glicoproteínas, se determina el contenido de carbohidratos (azúcares neutrales, azúcares aminados y ácidos siálicos). Además, se analiza la estructura de las cadenas de carbohidratos, el patrón de oligosacáridos (perfil antenado) y los sitios de glicosilación de la cadena polipeptídica en la medida de lo posible.”
Método Analítico
| Análisis |
Métodos |
| Ocupancia del Sitio de N-glicosilación |
LC-MS después de la digestión con deglicosidasa y proteasa |
Procedimientos
1. Digestión de proteínas para generar pequeños fragmentos de péptidos.
2. Liberación de N-glicanos usando endoglucosidasa H o PNGase F. La endoglucosidasa H corta el enlace entre los dos residuos de GlcNAc en el núcleo de los glicanos unidos por enlace N, mientras que la PNGase F es una glicoamidasa que rompe el enlace entre GlcNAc y Asn, liberando toda la cadena de azúcar y convirtiendo Asn en Asp con un aumento de masa de 1-Da.
3. Enriquecimiento de N-glicopéptidos mediante HILIC (Cromatografía Líquida de Interacción Hidrofílica)
4. Análisis de la ocupación del sitio de glicosilación unida por enlace N utilizando LC-ESI-MS/MS.
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