La ocupación del sitio de N-glicosilación es una característica fisiológica de las glicoproteínas y produce principalmente N-glicano. El servicio de análisis de ocupación del sitio de N-glicosilación de Yaohai Bio-Pharma se lleva a cabo mediante digestión, liberación, enriquecimiento y análisis mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas de ionización por electropulverización-espectrometría de masas (LC-ESI-MS/MS).
Hemos estado involucrados en la caracterización estructural de proteínas de varias moléculas grandes, incluidas vacunas de subunidades recombinantes, nanocuerpos/VHH/anticuerpos de dominio único (sdAb), fragmentos de anticuerpos, hormonas/péptidos, citocinas, factores de crecimiento (GF), enzimas, colágenos. etc.
Requisitos reglamentarios para la ocupación del sitio de N-glicosilación
Según la directriz ICH Q6B, “para las glicoproteínas, se determina el contenido de carbohidratos (azúcares neutros, aminoazúcares y ácidos siálicos). Además, la estructura de las cadenas de carbohidratos, el patrón de oligosacáridos (perfil de antena) y los sitios de glicosilación de la cadena polipeptídica se analizan en la mejor medida posible”.
Método analítico
| Analisis |
Métodos |
| Ocupación del sitio de N-glicosilación |
LC-MS después de la digestión con desglicosilasa y proteasa |
Procedimientos
1. Digestión proteica de proteínas para generar pequeños fragmentos peptídicos.
2. Liberación de N-glicano usando endoglicosidasa H o PNGasa F. La endoglicosidasa H escinde el enlace entre los dos residuos de GlcNAc en el núcleo de los glicanos unidos a N, mientras que la PNGasa F es una glicoamidasa que corta el enlace entre GlcNAc y Asn, liberando todo el cadena de azúcar y convertir Asn en Asp con aumento de masa de 1-Da.
3. Enriquecimiento de N-glicopéptido mediante HILIC (cromatografía líquida de interacción hidrofílica)
4. Análisis de la ocupación del sitio de glicosilación ligada a N usando LC-ESI-MS/MS.
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