IVT mRNA-forberedelse

In vitro transkription (IVT) er den foretrukne metode til fremstilling af mRNA, der er i stand til at give mikrogram til milligram mRNA på laboratorieskala. Til forskningsformål har reagensleverandører udviklet alsidige IVT-reaktionssystemer, der er egnede til mRNA af moderat længde (1000-4000 nukleotider).

I denne artikel vil vi opsummere in vitro-transkription (IVT) af mRNA, herunder det konventionelle IVT-reaktionssystem, der anvendes i laboratorieskala, og IVT-reaktionssystemet, der er egnet til ultralangt mRNA (>9000 nukleotider).

Kits muliggør co-transkriptionel dækning med CleanCap AG og reducerer immunogenicitet med m1ψ. DNase I fjerner resterende DNA. Lavt udbytte kan skyldes dårlig blanding, reagensoxidation eller DNA-skabelonproblemer, som kan afbødes ved centrifugering, friske reagenser, kontroller og justering af skabelonmængde/reaktionstid.

Yaohai Bio-Pharma leverer forskellige præfabrikerede IVT RNA-produkter (flydende/frysetørret pulver) og LNP-færdige produkter, der koder for proteiner såsom fluorescerende proteiner (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinase Cre og antigen OVA, for at opfylde forskellige eksperimentelle eller projekter behov.

IVT-system til ultralangt mRNA

Konventionel IVT virker muligvis ikke for alt for langt mRNA (>9000 nt). En dyb forståelse og rationel tilpasning af IVT-komponenter er nødvendig.

DNA skabelon: Lineariserede plasmider eller PCR-produkter med tilsvarende promotorsekvenser, opløst i RNase-fri H2O. En DNA-skabelonkoncentration højere end 40 nM anbefales til optimale IVT-forhold.

DTT: Vedligeholder enzymaktivitet under transkription. Frisk DTT bør tilsættes til reaktionsbufferen for optimal enzymaktivitet.

RNase-hæmmer: Hæmmer RNase-aktivitet og opretholder mRNA-stabilitet.

T7 RNA polymerase: Katalyserer DNA-transkription til RNA, svarende til promotorsekvensen. Aktiviteten af ​​T7 RNA polymerase påvirkes af pH og magnesiumioner.

Magnesiumioner (Mg2+): En cofaktor for RNA-polymerase. For lave koncentrationer reducerer transskriptionseffektiviteten, mens for høje koncentrationer fører til RNA-nedbrydning. Fri [Mg2+] bør justeres baseret på nukleotidkoncentration. Hvert nukleotid chelaterer en [Mg2+], så [Mg2+]-koncentrationen bør overstige den totale nukleotidkoncentration.

Nukleosidtrifosfater (NTP): Som substrater er NTP'er de grundlæggende enheder af RNA. NTP-koncentrationer over 7 mM har en positiv indvirkning på mRNA-produktion.

Spermidin: Stabiliserer DNA-enzymkomplekser og stimulerer transkriptionsreaktioner; for høje koncentrationer har dog hæmmende virkninger. Den anbefalede spermidinkoncentration er mellem 1 og 3 mM.

Uorganisk pyrophosphatase (PPase): Tilføjet til IVT-reaktioner for at forhindre akkumulering af uorganiske pyrophosphationer (PPi), undgå deres chelering med Mg2+ og sikre tilstrækkelig fri Mg2+.

Ved at udnytte banebrydende teknologi og IVT mRNA-erfaring leverer Yaohai Bio-Pharma en one-stop IVT RNA-service, der omfatter sekvensdesign, IVT RNA-forberedelse (med m1ψ-mods), RNA-cyklisering, oprensning, frysetørring, LNP-indkapsling og kvalitetstest.

Vi søger også aktivt institutionelle eller individuelle globale partnere. Vi tilbyder den mest konkurrencedygtige kompensation i branchen. Hvis du har spørgsmål, er du velkommen til at kontakte os: [email protected]