Postopek izdelave eGFP mRNA

Proizvodnja mRNA eGFP (izboljšanega zelenega fluorescentnega proteina) vključuje vrsto tehnik molekularne biologije za ustvarjanje funkcionalne molekule RNA, ki kodira izražanje eGFP. Na področju eGFP mRNA si je Yaohai Bio-Pharma nabrala bogate izkušnje pri zagotavljanju posebnih potreb strank. Na podlagi naših izkušenj smo sintetizirali procesni tok za proizvodnjo mRNA EGFP.

1. Kloniranje gena eGFP: Za pridobitev genskega zaporedja, ki kodira eGFP. Ta gen je običajno kloniran iz že obstoječega plazmidnega vektorja ali sintetiziran umetno na podlagi znanega nukleotidnega zaporedja. Klonirani gen se nato preveri s sekvenciranjem, da se zagotovi točnost.
2. Optimizacija genov za izražanje: Za optimalno izražanje v ciljnem sistemu (npr. celicah sesalcev, bakterijah ali transkripcijskih sistemih in vitro) je lahko gen eGFP podvržen optimizaciji kodona. To vključuje zamenjavo redkih kodonov v izvirnem zaporedju s tistimi, ki se pogosteje uporabljajo v gostiteljskem organizmu, kar poveča možnosti za učinkovito prevajanje.
3. In vitro Priprava predloge za prepis: Ko je optimiziran gen pripravljen, se vključi v ustrezen vektor, pogosto plazmid, ki vsebuje regulatorne elemente, potrebne za transkripcijo (npr. promotorsko zaporedje). Ta plazmid služi kot predloga za transkripcijo in vitro.
4. In vitro Transkripcija: Z uporabo pripravljene plazmidne predloge se izvede transkripcija in vitro za sintezo eGFP mRNA. Ta proces vključuje uporabo encimov RNA polimeraze, ki prepoznajo zaporedje promotorja in sprožijo transkripcijo, pri čemer nastane komplementarna veriga RNA predlogi DNA. Odvisno od želene uporabe je lahko mRNA omejena, poliadenilirana in/ali modificirana za povečanje stabilnosti in učinkovitosti prevajanja.
5. Čiščenje in kontrola kakovosti: Sintetizirana eGFP mRNA se nato očisti, da se odstranijo morebitni onesnaževalci, vključno z DNA, beljakovinami in prostimi nukleotidi. Metode čiščenja lahko vključujejo gelsko elektroforezo, kolonsko kromatografijo ali ločevanje na osnovi kroglic. Po čiščenju se mRNA analizira glede kakovosti, vključno s koncentracijo, čistostjo in celovitostjo, z uporabo tehnik, kot sta UV-Vis spektrofotometrija in gelska elektroforeza.
6. Skladiščenje in dostava: Prečiščena mRNA eGFP je običajno shranjena pri nizkih temperaturah, da se ohrani stabilnost. Za eksperimentalno uporabo se lahko mRNA dostavi v celice z uporabo različnih metod, vključno z elektroporacijo, lipofekcijo ali virusnimi vektorji, odvisno od specifične uporabe in tipa ciljne celice.
7. Izražanje in preverjanje: Ko je v celici, se mRNA eGFP prevede v izboljšan zeleni fluorescentni protein, ki ga je mogoče prikazati s fluorescenčno mikroskopijo. To omogoča preverjanje uspešne proizvodnje, dostave in izražanja mRNA.

Če povzamemo, proizvodnja eGFP mRNA vključuje kloniranje gena, njegovo optimizacijo za izražanje, pripravo transkripcijske predloge in vitro, izvedbo transkripcijske reakcije, čiščenje nastale mRNA in končno dostavo v celice za izražanje in preverjanje.

Aktivno iščemo tudi institucionalne ali individualne globalne partnerje. Ponujamo najbolj konkurenčno nadomestilo v panogi. Če imate kakršna koli vprašanja, nas kontaktirajte: [email protected]