Os dados de mapeamento de peptídeos baseados em cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) fornecerão uma grande quantidade de informações sobre a estrutura primária e de ordem superior de proteínas nativas e recombinantes, incluindo cobertura de sequência de aminoácidos, modificações pós-traducionais (PTMs, por exemplo, glicosilação , oxidação, desamidação), ligações dissulfeto, etc.
A Yaohai Bio-Pharma oferece serviços de análise de mapeamento de peptídeos para sua proteína alvo por LC-MS, para acelerar sua pesquisa sobre a estrutura da proteína.
Estamos envolvidos na caracterização estrutural de proteínas de várias moléculas grandes, incluindo vacinas de subunidades recombinantes, nanocorpos/VHHs/anticorpos de domínio único (sdAbs), fragmentos de anticorpos, hormônios/peptídeos, citocinas, fatores de crescimento (GF), enzimas, colágenos, etc.
Requisitos regulatórios para mapeamento de peptídeos
A diretriz ICHQ6B recomenda: “A fragmentação seletiva do produto em peptídeos discretos é realizada usando enzimas ou produtos químicos adequados e os fragmentos de peptídeos resultantes são analisados por HPLC ou outro procedimento analítico apropriado. Os fragmentos peptídicos devem ser identificados, tanto quanto possível, utilizando técnicas como análise da composição de aminoácidos, sequenciação N-terminal ou espectrometria de massa (MS). O mapeamento peptídico da substância ativa ou medicamento (DP) usando um método adequadamente validado é um método frequentemente usado para confirmar a estrutura do produto desejada para liberação em lote.”
Métodos analíticos
| Análise |
De Depósito |
| Mapeamento de Peptídeos |
Digestão de protease e cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) |
Procedimento analítico
1. Redução e Alquilação
O objetivo é reduzir as pontes dissulfeto e bloquear o tiol livre gerado. A redução das pontes dissulfeto ajuda a abrir a estrutura da proteína, o que torna a digestão proteolítica mais eficiente. Esta etapa também quebrará as pontes entre as cadeias no caso de proteínas de múltiplas cadeias que possuem pontes dissulfeto ligando as cadeias (por exemplo, anticorpos monoclonais, mAbs).
2. Digestão da proteína usando enzimas
O objetivo é quebrar a proteína em peptídeos. Escolhemos as enzimas com base na sequência teórica da proteína e no conhecimento da digestão teórica da proteína por enzimas. Escolhendo enzimas desta forma, deve resultar na melhor análise de mapeamento de peptídeos.
3. Análise dos Peptídeos Digeridos Usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa on-line com detecção espectrométrica de massa ultravioleta (UV) e eletrospray (LC/ES-MS).
Separação de peptídeos baseada na polaridade usando LC (LC de fase reversa)
À medida que o peptídeo elui da coluna LC, o espectrômetro de massa irá gerar informações de massa juntamente com informações de íons de fragmentos, o que nos permite determinar as informações de sequência. Usamos as informações da sequência para confirmar a identidade do peptídeo e fornecer informações primárias.
Também podemos gerar as informações de fragmentação dos peptídeos à medida que eles entram na fonte do espectrômetro de massa a partir da coluna LC. Dependendo dos requisitos do estudo, este é um LC-MS/MS seletivo ou não seletivo, que pode ser considerado uma forma de MS em tandem.
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