Dados de mapeamento de peptídeos baseados em Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa (LC-MS) fornecerão uma grande quantidade de informações sobre a estrutura primária e de ordem superior de proteínas nativas e recombinantes, incluindo cobertura da sequência de aminoácidos, modificações pós-tradicionais (MPTs, por exemplo, glicosilação, oxidação, desamidação), ligações dissulfídricas, etc.
Yaohai Bio-Pharma oferece serviços de análise de mapeamento de peptídeos para sua proteína alvo por LC-MS, para acelerar suas pesquisas sobre a estrutura de proteínas.
Estivemos envolvidos na Caracterização Estrutural de Proteínas de várias grandes moléculas, incluindo Vacinas Recombinantes de Subunidades, Nanocorpos/VHHs/ Anticorpos de Domínio Único (sdAbs), Fragmentos de Anticorpos, Hormônios/Peptídeos, Citocinas, Fatores de Crescimento (GF), Enzimas, Colágenos, etc.
Requisitos Regulatórios para Mapeamento de Peptídeos
A diretriz ICHQ6B recomenda: “A fragmentação seletiva do produto em peptídeos discretos é realizada usando enzimas ou químicos apropriados e os fragmentos peptídicos resultantes são analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou outro procedimento analítico apropriado. Os fragmentos peptídicos devem ser identificados na medida do possível usando técnicas como análise da composição de aminoácidos, sequenciamento N-terminal ou espectrometria de massa (MS). O mapeamento peptídico da substância ativa ou produto farmacêutico (DP) usando um método validado adequadamente é um método frequentemente utilizado para confirmar a estrutura do produto desejado para liberação de lote.”
Métodos Analíticos
| Análise |
Métodos |
| Mapeamento de Peptídeos |
Digestão com Protease e Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa (LC-MS) |
Procedimento Analítico
1. Redução e Alquilção
O objetivo é reduzir pontes dissulfídeas e bloquear o tiol livre gerado. A redução das pontes dissulfídeas ajuda a abrir a estrutura da proteína, tornando a digestão proteolítica mais eficiente. Esta etapa também quebrará as pontes entre as cadeias no caso de proteínas multicadeia que possuem pontes dissulfídeas ligando as cadeias (ex.: anticorpos monoclonais, mAbs).
2. Digestão da Proteína Usando Enzimas
O objetivo é dividir a proteína em peptídeos. Escolhemos as enzimas com base na sequência teórica da proteína e no conhecimento da digestão teórica da proteína pelas enzimas. Ao escolher as enzimas dessa forma, deve-se obter a melhor análise de mapeamento de peptídeos.
3. Análise dos Peptídeos Digestados Usando Cromatografia Líquida de Fase Reversa On-line com Detecção por Ultravioleta (UV) e Espectrometria de Massa por Eletrospray (LC/ES-MS).
Separação de peptídeos com base na polaridade usando LC (fase reversa-LC)
À medida que o peptídeo é eluído da coluna de LC, o espectrômetro de massa gerará informações de massa juntamente com informações de íons de fragmento, o que nos permite determinar as informações de sequência. Usamos as informações de sequência para confirmar a identidade do peptídeo e fornecer informações primárias.
Também podemos gerar informações de fragmentação dos peptídeos à medida que eles entram na fonte do espectrômetro de massa a partir da coluna de LC. Dependendo dos requisitos do estudo, isso pode ser seletivo LC-MS/MS ou não seletivo, o que pode ser considerado uma forma de MS em tandem.
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